TSA多色免疫熒光技術(shù)教程
2025-01-06 17:02:10
來(lái)源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺(tái)
TSA多重免疫熒光技術(shù)，也稱(chēng)為多重免疫組化（mIHC），是一項(xiàng)能在給定組織切片上，以逐步增加能量的方式同時(shí)檢測(cè)多種目的蛋白的技術(shù)。
普拉特澤生物承接TSA多色免疫熒光等病理染色相關(guān)服務(wù)上萬(wàn)例，積累了操作大量經(jīng)驗(yàn)，為大家詳細(xì)分享TSA多色免疫熒光技術(shù)教程
同時(shí)為廣大科研工作者開(kāi)展線(xiàn)上的理論培訓(xùn)與線(xiàn)下實(shí)操，可承接染色實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)
——下面，就為大家?guī)?lái)TSA多色免疫熒光技術(shù)的詳細(xì)教程。
一、實(shí)驗(yàn)原理
TSA技術(shù)利用辣根過(guò)氧化酶（HRP）對(duì)靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記。在過(guò)氧化氫（H2O2）環(huán)境中，非活性的酪胺分子（T）被二抗偶聯(lián)的HRP催化激活，發(fā)生大量的酶促反應(yīng)
成為具有短暫活性的中間態(tài)分子（T*）并形成共價(jià)鍵結(jié)合位點(diǎn)與鄰近蛋白（包括靶抗原蛋白、一抗、二抗及HRP）的富電子區(qū)域（如色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基）發(fā)生共價(jià)偶聯(lián)而沉積。
偶聯(lián)在酪胺分子上的熒光染料從而在共價(jià)偶聯(lián)蛋白周?chē)罅砍练e，使信號(hào)被有效放大。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
【1】脫蠟復(fù)水?
1.1將切片放入烤箱中，60-65℃烤片，時(shí)間根據(jù)切片厚度和實(shí)驗(yàn)室條件調(diào)整，一般在1-2小時(shí)之間。之后立即放入二甲苯或環(huán)保型脫蠟液中進(jìn)行脫蠟，重復(fù)3次，每次10分鐘。
1.2將切片放入梯度乙醇中進(jìn)行水化：100%乙醇5分鐘，重復(fù)2次；95%乙醇5分鐘；90%乙醇5分鐘（此步驟可根據(jù)需要選擇是否進(jìn)行）；80%或75%乙醇5分鐘。之后用滅菌水洗片1分鐘，重復(fù)3次。
【2】抗原修復(fù)?
1.1將脫蠟水合后的玻片置于修復(fù)杯中，用抗原修復(fù)液（如檸檬酸、檸檬酸鈉或EDTA等）浸沒(méi)。
1.2將修復(fù)杯置于微波爐內(nèi)高火煮沸，之后低火維持15-20分鐘。修復(fù)完成后，取出室溫自然冷卻至室溫，或用冰水快速降溫。
【3】封閉?
1.1去除玻片上殘存洗液，用組化筆或免疫組化筆在組織周?chē)?huà)圈。
1.2滴加適量封閉液，覆蓋樣本區(qū)域，室溫封閉30分鐘。
?【4】一抗孵育?
1.1去除玻片上的封閉劑，用移液器滴加稀釋的一抗溶液，浸沒(méi)樣本區(qū)域。
1.2室溫或37℃保濕振蕩孵育1-2小時(shí)（需針對(duì)不同抗體做優(yōu)化調(diào)整）。
1.3用1×TBST buffer浸洗玻片3分鐘，重復(fù)1-3次。
【5】二抗孵育?
1.1去除玻片上殘存的洗液，直接滴加與一抗相對(duì)應(yīng)的二抗工作液（HRP標(biāo)記），浸沒(méi)樣本區(qū)域。
1.2室溫保濕孵育10分鐘。
1.3用1×TBST buffer浸洗玻片3分鐘，重復(fù)1-3次。
【6】?TSA信號(hào)放大?
1.1去除玻片上殘存的洗液，滴加TSA工作液（用信號(hào)放大反應(yīng)液按一定比例稀釋?zhuān)](méi)樣本區(qū)域。
1.2室溫保濕振蕩孵育10-15分鐘。
1×TBST buffer浸洗玻片，室溫浸片3分鐘，重復(fù)3次。之后進(jìn)行微波修復(fù)洗脫，室溫自然冷卻至室溫。再用滅菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2分鐘。
【7】重復(fù)染色?
如果需要進(jìn)行多色標(biāo)記，則重復(fù)步驟2至步驟6，但每次需更換不同靶蛋白的抗體和不同激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)的TSA染料。
?【8】細(xì)胞核染色?
去除玻片上殘存洗液，滴加DAPI工作液，室溫保濕孵育5-10分鐘。1×TBST buffer浸洗玻片，室溫浸片3分鐘，重復(fù)3次。之后用滅菌水洗片2分鐘。
【9】?封片?
1.1待玻片微干，用移液器在玻片上滴加抗淬滅封片劑，浸沒(méi)樣本區(qū)域。
1.2加蓋玻片，用指甲油封片。
【10】?封片??成像?
使用全光譜成像設(shè)備、標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡或多光譜組織成像系統(tǒng)對(duì)多重染色切片進(jìn)行掃描成像。
三、注意事項(xiàng)
1.實(shí)驗(yàn)前應(yīng)設(shè)計(jì)好實(shí)驗(yàn)方案，包括一抗與TSA熒光染料的搭配以及染色的順序。
2.盡量選擇特異性高的一抗，以確保染色結(jié)果的準(zhǔn)確性。
3.低表達(dá)指標(biāo)盡量與高亮度染料搭配，高表達(dá)指標(biāo)與低亮度染料搭配，以?xún)?yōu)化染色效果。
4.實(shí)驗(yàn)過(guò)程注意避免切片干燥，以免影響染色結(jié)果。
通過(guò)以上步驟，你就可以掌握TSA多色免疫熒光技術(shù)的基本操作方法了。希望這篇教程能對(duì)你的實(shí)驗(yàn)工作有所幫助！好還有關(guān)于TSA多色免疫熒光技術(shù)更多問(wèn)題咨詢(xún)的歡迎留言哦
技術(shù)小姐姐會(huì)第一時(shí)間給到最專(zhuān)業(yè)的回復(fù)噠！
還有需要TSA多色免疫熒光技術(shù)代做服務(wù)請(qǐng)認(rèn)準(zhǔn)咱們普拉特澤哦
電話(huà)：400-691-6686
在線(xiàn)時(shí)間：8:00-24:00
微信關(guān)注公眾號(hào)
湘公網(wǎng)安備