10μM EdU孵育2小時：貼壁與懸浮細胞最佳處理方案指南
2025-06-26 12:17:44
來源/作者：普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺
細胞增殖研究的精度往往隱藏在實驗細節中。EdU檢測技術革新了傳統方法，而10μM濃度下2小時的孵育時間正是大多數哺乳動物細胞平衡標記效率與細胞活性的黃金節點。
本篇由普拉特澤生物細胞檢測平臺總結分享，細胞檢測平臺為廣大科研實驗人員提供EDU檢測細胞增殖外包實驗服務，先一起來學習學習什么是細胞實驗吧。
細胞增殖檢測是評估細胞活性、代謝狀態及生理病理變化的核心手段。EdU（5-乙炔基-2’-脫氧尿苷）檢測技術作為BrdU方法的升級換代方案，通過點擊化學反應實現DNA合成期細胞的高效標記。
與傳統BrdU法相比，EdU技術無需DNA變性處理，避免了劇烈的酸解、熱解或酶解操作。這一特性不僅保護了細胞形態和DNA結構的完整性，還保留了細胞內抗原識別位點，為多重實驗設計提供了便利。
10μM EdU孵育2小時已成為HeLa、3T3、HEK293等常見哺乳動物細胞系的標準方案，其科學依據在于：大多數哺乳動物細胞周期約為18-25小時
而2小時孵育恰好占其細胞周期的約10%，既能有效標記S期細胞，又最大限度減少了對細胞正常代謝的干擾
——01 EdU檢測的核心優勢與原理
EdU檢測的核心優勢在于其獨特的“點擊化學”（Click Chemistry）反應機制。EdU作為胸苷類似物，在DNA合成期主動摻入新合成的DNA鏈中。其分子末端的乙炔基團可與熒光標記的疊氮化物（如Azide 488、Azide 594）在一價銅離子催化下形成穩定的三唑環，實現共價結合。
這一反應具有三大獨特優勢：
▲反應迅速高效：30分鐘內即可完成，大幅縮短實驗時間
▲無需DNA變性：避免傳統BrdU法所需的嚴苛變性處理（HCl或酶解）
▲小分子探針：分子量僅為BrdU抗體的1/5
這些特性使EdU技術特別適合多重標記實驗設計。研究人員可同時進行細胞核染色（如Hoechst 33342）、免疫熒光檢測（如P65抗體）以及細胞周期蛋白標記，在單細胞水平獲取多維信息。
不同細胞類型對EdU的摻入效率存在顯著差異。下表總結了各類細胞的推薦處理參數：
表：不同細胞類型的EdU處理參數參考
實驗設計時需注意：初次使用應進行濃度梯度測試。若實驗室有BrdU使用經驗，可參考原有BrdU濃度作為EdU起始濃度。
——02 貼壁細胞EdU處理標準化方案
貼壁細胞作為實驗室最常用的模型系統，其EdU標記需精細控制細胞狀態和操作細節。以下為優化的標準流程：
細胞準備階段
將細胞接種于6孔板或含蓋玻片的培養器皿中
培養過夜使細胞恢復自然狀態，匯合度達80%左右為最佳
進行所需的藥物處理或其他刺激處理
EdU工作液配制 用預熱的完全培養基按1：500比例稀釋10mM EdU母液
獲得2×工作液（20μM）
關鍵提示：不要更換全部培養基，僅需等體積加入2×工作液
孵育與固定
→加入預熱至37℃的2×EdU工作液
→37℃孵育精確2小時（多數哺乳動物細胞）
→棄培養液，加入4%多聚甲醛（PFA）室溫固定15分鐘
使用含3% BSA的PBS洗滌3次，每次5分鐘
透化與點擊反應
加入0.3% Triton X-100通透液室溫處理10-15分鐘
配制Click反應液（嚴格按順序混合）：
Click反應緩沖液
CuSO?溶液
熒光疊氮化物（如Azide 488）
Click添加劑溶液
加入反應液覆蓋樣品，室溫避光反應30分鐘135
核染色與檢測
用1：1000稀釋Hoechst 33342（1×工作液）染色10分鐘
PBS洗滌后即可觀察
熒光顯微鏡檢測通道：
Hoechst 33342：Ex/Em=346/460 nm（藍）
Azide 488：Ex/Em=495/519 nm（綠）
注意要點：Click反應液必須現配現用（15分鐘內使用），且組分添加順序不可顛倒，否則反應效率將顯著降低。
——03 懸浮細胞EdU處理關鍵技術
懸浮細胞的EdU標記面臨獨特挑戰：細胞不易沉降、操作中易丟失、固定后難以附著。需采用特殊方法處理：
EdU標記與樣本制備
在培養基中直接添加10μM EdU（終濃度）
37℃孵育2小時
關鍵差異點：需離心收集細胞（1000×g，5分鐘）
沉淀用PBS重懸后制備細胞涂片：
載玻片上滴加細胞懸液
酒精燈溫和烘干固定
固定與透化
→加入4%多聚甲醛室溫固定15分鐘
→含3% BSA的PBS洗滌3次
→0.5% Triton X-100通透處理15分鐘
點擊反應優化
配制Click反應液時增加10%體積
懸浮細胞更易產生背景信號
反應后建議：
→0.5% Triton X-100洗滌2次
→甲醇加強清洗（可選，高背景時使用）
→流式細胞術特殊處理
EdU孵育后無需制備涂片
先用培養基重懸細胞
再進行固定和透化
Click反應后直接上機分析
核心挑戰應對：懸浮細胞在固定和洗滌步驟易丟失。解決方案包括：
低速離心（800-1000×g）
離心前加入載體蛋白（如1% BSA）
減少洗滌次數（不低于2次）
——04 組織樣本與體內EdU標記方案
EdU技術不僅適用于體外培養細胞，還可實現活體水平的增殖檢測，為組織再生、腫瘤生長等研究提供有力工具。
動物體內標記
小鼠給藥方案：
腹腔注射EdU溶液
→劑量范圍：10-200 mg/kg體重
→首次實驗推薦50 mg/kg
給藥方式選擇：
腹腔注射（最常用）
局部組織注射
飲用水給藥（長期標記）
時間控制：
標準時間：4小時
可根據研究目的延長至24小時
組織樣本處理
處死動物后迅速取材
冰凍切片制備：
4%多聚甲醛固定15分鐘
0.3% Triton X-100透化15分鐘
石蠟切片制備：
常規脫蠟（二甲苯-乙醇梯度）
抗原修復非必需（EdU檢測無需抗體）
切片EdU檢測
切片厚度建議：5-7μm
直接進行Click反應（30分鐘）
可選核染色（DAPI或Hoechst）
封片觀察
特別提示：若同時進行目標蛋白的免疫熒光染色，且需抗原修復時：
避免使用蛋白酶K或胰酶處理
選擇熱介導的抗原修復法
修復后徹底清洗，防止酶殘留干擾點擊反應
——05 實驗失敗常見原因與解決方案
即使經驗豐富的科研人員也可能遭遇EdU檢測的陷阱。以下為常見問題及專業解決方案：
標記信號弱或無信號
濃度不足：對生長緩慢細胞（如神經細胞），可將 EdU 濃度提高至 50μM；對快速增殖細胞（如胚胎細胞），可縮短孵育時間（如 1 小時），無需提高濃度（避免細胞毒性）
孵育時間不當：確認細胞周期時間，調整占周期10%左右
反應液失效：Click反應液配制后須15分鐘內使用，且必須按緩沖液→CuSO?→Azide→添加劑的順序混合
背景信號過高
洗滌不充分：增加Triton X-100洗滌次數（最高5次），每次10分鐘
非特異性結合：BSA濃度提高至5%，或添加5%正常血清封閉
細胞碎片干擾：上樣前通過40μm細胞篩過濾
細胞形態損傷
→透化過度：降低Triton X-100濃度至0.1%或縮短處理時間
→固定過久：多聚甲醛固定不超過15分鐘
→懸浮細胞脆弱：離心速度不超過1000×g，重懸時避免吹打
多重染色干擾
熒光串擾：優化濾光片設置，順序拍攝不同通道
抗體交叉反應：先進行免疫染色，后執行Click反應
自發熒光：使用新鮮配制的抗淬滅封片劑
——06 方案優化與新技術進展
隨著技術進步，EdU實驗方案也在不斷優化。以下為提升數據質量的進階策略：
動態監測技術：通過脈沖追蹤實驗設計，可實現細胞周期進程的連續監測。
方法：
首次EdU標記（10μM，30分鐘）
更換普通培養基
不同時間點固定細胞
使用不同顏色Azide（如Alexa Fluor 555）二次標記
高通量篩選適配：
96/384孔板微型化體系
Click反應液體積縮減至50μL（96孔板）
自動化加樣設備兼容
高內涵成像系統分析
表：不同培養容器Click反應體系配置參考
三維培養系統：類器官和球狀體模型的EdU標記需特殊處理：
增加EdU滲透時間（至4小時）
透化時間延長至1小時
振動培養促進試劑滲透
流式分析優化：
貼壁細胞消化后固定
Azide 594標記更適合紅色激光流式細胞儀
結合PI或7-AAD進行細胞周期同步分析
冷凍樣本處理：
凍存組織切片可進行EdU檢測
避免反復凍融
增加通透時間至30分鐘
細胞增殖研究正從二維培養走向類器官，從終點檢測走向實時動態監測。10μM EdU孵育2小時作為經典方案，其價值不僅在于結果本身，更在于其作為標準化基準，使跨實驗室數據比較成為可能。
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