【完整版】小鼠灌流及取腦實驗 Protocol，新手也能輕松上手
2025-10-11 17:32:20
來源/作者：普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺
普拉特澤生物為廣大生命科學研究人員提供動物實驗，可根據實方案的要求選擇不同的檢測方法，本文就跟大家一起繼續探究小鼠灌流及取腦實驗 Protocol，新手也能輕松上手~·
在對腦組織進行切片和免疫染色或原位雜交等實驗之前，為了排除血液對實驗的干擾，通常會對小鼠心臟灌流后再進行解剖和切片。
實驗前準備
1）灌流裝置：50mL 注射器 + 輸液管、灌流針頭（23G 或 25G 靜脈輸液針，剪去針尖斜面保留鈍頭，避免刺破血管）。（或有的實驗室可直接用注射泵）
2）手術器械：眼科剪（直 / 彎各 1 把）、眼科鑷（直 / 彎各 1 把）、止血鉗（2 把）、大頭針、泡沫板、培養皿（6cm/10cm，用于盛放組織）。
3）其他：2個50ml離心管、PBS、4% 多聚甲醛（PFA）固定液<有毒注意安全>、塑料袋（裝小鼠尸體）、手術巾、一次性手套口罩。
實驗步驟
麻醉固定
1）麻醉：腹腔注射4%水合氯醛（0.1ml/10g）：夾捏后肢無反應、呼吸平穩。（現在水合氯醛不符合動物倫理，不鎮痛，按需換用其他麻醉方式：舒泰，各種牌子的肌松，戊巴比妥，三溴乙醇，異氟烷等）
2）固定：仰臥位固定于泡沫板上，用大頭針固定四肢（前肢呈 “外八字”，后肢伸直），腹部朝上，用手術巾擦拭腹部及胸部毛發。
（附：腹腔注射）
1）抓取小鼠：
放在飼養籠上，提其尾巴中部，水平偏下往后輕拉，小鼠爪子會自然會抓住籠子，此時應該迅速抓住小鼠的頸背部的皮毛，最好是抓在小鼠的耳朵處，這樣可以更好固定小鼠的頭部，以防被咬。（但切記力氣不要過大，容易使小鼠窒息）。
再將小鼠的尾巴用左手無名指或小拇指固定，這樣就可以將小鼠整個軀干固定好，注意一定要讓小鼠處于一個舒服的體位，如果小鼠軀干不能保持豎直，很容易扎到臟器，引起出血，影響實驗。
2）注射：
抓取小鼠后，應腹部向上，頭呈低位（使臟器移至低位，避免扎傷）。右手持注射器，插入小鼠腹部，注射部位為小鼠后肢根部連線處任一側1.5cm處（建議從左側進針，右側重要器官比較多 避免扎入），緩慢以45度左右進針，進針深度小于1cm，進針的感受為局部皮膚凹陷消失和落空感，可回抽看是否有血液/尿液。
3）拔針：
為了防止漏液，輕微旋轉針頭，再緩緩拔出。
在實驗前，準備酒精棉球，注射器在使用后要消毒才能給下一只小鼠使用，避免交叉感染。此外，注射前，也可以用酒精棉球擦拭小鼠皮膚，可以明顯辨別藥物是否注射到腹腔，如果看到鼓包，就是注射到皮下了。
暴露心臟與血管
1）剪開皮膚：用眼科剪從劍突下沿腹中線向上剪開皮膚（長度約 2cm），再向兩側橫向剪開，暴露胸肌。
打開胸腔：用眼科剪沿肋骨兩側（避開心臟）向上剪開胸骨，打開胸腔，此時可見心臟（左心室呈粉紅色，右心房呈暗紅色）。
灌流操作
1）進針：左手持止血鉗固定心臟，右手將灌流針頭（提前連接輸液管，排空氣泡）從左心室心尖部（左心室最下端的尖狀結構）斜向頭端刺入（角度約 30°，深度 3-5mm）刺入后用止血鉗將針頭與心肌一起夾住固定（避免針頭脫出）。
2）剪開右心耳：用眼科鑷提起右心耳（右心房上方的暗紅色小囊狀結構），用眼科剪剪一小口（約 1mm），作為灌流液流出通道（放血口）。
3）PBS 沖洗（去血）：推注注射器，先灌注 0.01M PBS（37℃或室溫，20g 小鼠用量 15-20mL，速度 5-10mL/min），先慢后快。觀察指標：右心耳流出液從紅色逐漸變清，肝臟由紅變白，四肢輕微抽搐后停止，說明血液沖洗充分（約 3-5 分鐘）。
4）PFA 固定：PBS 沖洗完成后，迅速切換至 4% PFA（4℃，用量與 PBS 相同，速度稍慢至 3-5mL/min）。觀察指標：灌流時小鼠四肢逐漸僵硬，腹部鼓起，口鼻有少量固定液溢出，說明固定液已擴散至全身（約 5-8 分鐘）（尾巴翹起說明灌流效果好）。
（步驟3）和4）也可用注射泵
5）終止灌流：PFA 灌流結束后，先拆開注射器輸液管，再拔出針頭，避免液體回流。
取腦組織
1）斷頭存放：從緊貼著耳朵后面的地方斷頭，迅速把頭放進生理鹽水的冰水混合物里，冷卻30s。
2）開顱取腦：
從兩耳之間剪皮至兩眼之間，把鼠的頭皮整個往上扒，橫截面可見一個白點，是延髓；
從有延髓的孔把周圍的骨頭沿著上下左右的生長方向拔掉，可見小腦；
小腦上方可見四大片頭蓋骨，逐個向上掀開，可見完整大腦；
用彎鑷從大腦最前端伸入大腦下方，拔斷十二對腦神經和小腦神經連接，
即可取出。
3）標本后固定、脫水：
將游離出的全腦放入 4%多聚甲醛 PBS 中，放于 4°C 后固定（不超過 24 小時）。
PBS 清洗后脫水（30%的蔗糖溶液沉底）處理。
文源自粥小八
如侵則刪
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好，小鼠灌流及取腦實驗 Protocol就介紹到這里啦~
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