給大家總結了一下普拉特澤生物常用qPCR加樣的布板方式,可以盡可能的減少誤差
取出跑qPCR的試劑盒,冰上融化,cDNA 稀釋5-10倍(具體稀釋倍數大家參考說明書)
實時熒光定量 PCR(qPCR)作為分子生物學領域定量分析核酸的核心技術,其結果的準確性、重復性與孔板設計及加樣操作直接相關??装逶O計的核心目標是通過合理規劃樣品、目的基因與技術重復的排布,消除實驗誤差(包括系統誤差與隨機誤差),確保數據的統計學可靠性。其中,技術重復設置是關鍵環節 —— 通過對同一樣品的同一目的基因進行多次平行檢測(常規為 3 次重復),可有效降低加樣誤差、反應體系不均一等隨機因素對結果的影響,為后續 Ct 值分析、熔解曲線驗證及相對定量計算(如 2?ΔΔCt 法)提供可靠的數據基礎。
孔數計算的邏輯推導與實例驗證
(一)計算邏輯的科學依據
孔數的確定需覆蓋 “樣品維度 - 基因維度 - 重復維度” 的全要素,其核心公式推導如下:
單一目的基因的檢測孔數 = 樣品數量 × 技術重復次數(n=3,符合生物統計學中平行重復的最低要求,可通過標準差分析評估數據離散度);
總檢測孔數 = 單一目的基因的檢測孔數 × 目的基因總數(含內參基因)。
該公式的本質是實現 “每個樣品的每個基因均獲得獨立且可重復的檢測數據”,避免樣品交叉污染或重復不足導致的數據可信度不足。內參基因(如 GAPDH、β-actin)作為標準化參照,需與目的基因遵循相同的重復設置原則,以確保樣品間 RNA 提取效率、逆轉錄效率及 PCR 擴增效率的校準準確性。
(二)實例拓展與驗證
以 “8 個樣品 + 5 個目的基因 + 1 個內參基因” 為例,按上述邏輯計算總孔數:
總孔數 = 樣品數(8)× 基因總數(5+1=6)× 技術重復數(3)= 8×6×3=144 孔。
該結果適用于 96 孔板(需分 2 塊板,每塊板設置陰性對照與空白對照各 3 孔)或 384 孔板(單塊板即可完成,預留孔位用于梯度驗證)。若減少技術重復數至 2 次,雖可降低孔數(8×6×2=96 孔),但會導致數據變異系數(CV)升高,建議僅在樣品量有限且預實驗驗證重復性良好時采用。
三、孔板布局的優化原則
避免邊緣效應:qPCR 反應中,孔板邊緣孔的溫度傳導效率與中心孔存在差異,易導致 Ct 值偏移。建議將樣品孔集中在板的中心區域,邊緣孔用于設置陰性對照(NTC,無模板對照)、陽性對照(PC,已知陽性模板)及空白對照(Blank,僅含反應液)。
重復孔相鄰排布:同一樣品的同一基因重復孔應相鄰設置,減少移液器移液距離導致的加樣誤差,同時便于后續數據合并分析。
基因與樣品分組明確:可按 “行 = 基因,列 = 樣品” 或 “行 = 樣品,列 = 基因” 的方式布局,例如:第 1-3 列設置樣品 1 的 6 個基因(每個基因 3 個重復),第 4-6 列設置樣品 2 的 6 個基因,依次類推,避免不同基因或樣品交叉混淆。
對照孔均勻分布:陰性對照與空白對照應均勻分布在板中,而非集中于同一區域,以全面評估整個反應體系的污染情況。
四、加樣操作的規范流程與注意事項
(一)加樣順序與體積控制
優先配制混合反應液(含酶、引物、探針、緩沖液等),按總孔數 + 10% 的余量計算體積,避免因移液損耗導致樣品不足。
采用 “先加混合液,后加模板” 的順序:向每個孔中加入等量混合反應液(如 10μL / 孔),再加入模板(如 2μL / 孔),避免模板提前暴露于高溫或酶活性環境中。
移液時使用帶濾芯吸頭,避免交叉污染;每加完一個樣品或基因后更換吸頭,加樣體積誤差需控制在 ±0.5μL 以內(對于 20μL 體系)。
(二)防污染與反應均一性保障
1. 加樣前將模板與混合反應液充分混勻(模板輕柔顛倒混勻,混合液渦旋混勻后短暫離心),避免局部濃度不均。
2. 加樣后對孔板進行短暫離心(3000rpm,1min),使液體匯集于孔底,避免氣泡產生(氣泡會影響熒光信號檢測)。
3. 全程在冰上操作,減少酶活性喪失;加樣完成后立即密封孔板(使用光學密封膜),避免蒸發或污染。
(三)特殊情況處理
若樣品為 RNA(直接進行 RT-qPCR),需嚴格控制 RNase 污染,所有耗材(吸頭、離心管、孔板)均需無 RNase 處理,加樣過程中避免說話或呼氣靠近樣品。 五、總結 qPCR 孔板設計與加樣操作是實驗成功的基礎,其核心邏輯是通過 “全要素覆蓋的孔數計算”“誤差最小化的布局優化” 及 “標準化的加樣流程”,確保數據的準確性與重復性。實際實驗中,需根據樣品量、基因數量、儀器型號(96 孔板 / 384 孔板)靈活調整計算方式與布局策略,同時重視對照設置與污染防控,為后續定量分析提供可靠的實驗基礎。
具體布板和點樣方法,其實沒有固定范式,大家有好的加樣點樣技巧也歡迎分享~



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