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亞硫酸氫鈉測序（BSP）實驗步驟【BSP外包】

2022-11-22 15:00:00

來源/作者：普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺

亞硫酸氫鈉測序（BSP）實驗步驟由普拉特澤生物分享，亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，所有未發生甲基化的胞嘧啶(C)都被轉化為尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶則不變。通過設計針對甲基化序列的引物并進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析，將符合預期的產物純化回收連接T載體，進行陽性克隆測序即可獲取某個特定基因區段內每個CpG位點的甲基化程度。普拉特澤生物表達檢測平臺長期為廣大科研人員提供亞硫酸氫鈉測序外包服務，本文咱們就一起來看看BSP實驗的詳細操作步驟吧~

1、引物設計

在GenBank上找到待檢基因啟動子區的原始序列，輸入到“MethPrimer”軟件中，輸入啟動子序列，選擇“Pick primers for bisulfite sequencing PCR?or restriction PCR?”，其他參數選擇程序默認值，點擊“Submit”，“MethPrimer”軟件即可顯示預測的啟動子序列的CpG島，及引物的相應位置，同時也顯示設計的BSP引物。選擇多對引物進行預實驗，最終確定引物序列。

2、基因組提取

使用天根的TIANamp Genomic DNA Kit血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（實驗步驟見PDF:TIANamp Genomic DNA Kit），分別提取各樣本基因組。提供的細胞量要求大于10^6個。提取濃度在100-400 ng/μL之間，OD 260/280均在1.8-2.0之間，提取質量合格。

3、亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA

（1）將提取獲得的基因組DNA 3 μg以無菌雙蒸水稀釋至50μl，然后加入NaOH （終濃度為0.2 M）在42℃水浴變性30 min。

（2）依次加入30μl 10mM對苯二酚（氫醌）、520μl 3 M亞硫酸氫鈉（pH=5.0要求精準）至上述水浴后混合液中，輕柔顛倒混勻。

（3）加入200μl石蠟油，防止水分蒸發，限制氧化；50℃避光水浴16h。

4、修飾后DNA純化回收

修飾后的DNA使用純化試劑盒進行過柱純化，回收后用50μl無菌雙蒸水溶解，并測定濃度。

5、PCR擴增

PCR引物設計、退火溫度選擇、Taq酶及Buffer的選擇都會影響擴增的成敗，需要不斷優化。

6、擴增產物回收

將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后，進行膠回收，步驟如下：在紫外燈下，切下包含目的片段的膠條。用天平稱量總重量并減去空管的重量算出凝膠的重量，按100mg=100μL來計算凝膠的體積，并加入1倍凝膠體積的Binging Solution置于65℃水浴鍋內將凝膠徹底融化。期間適當搖晃EP管，加快凝膠的溶解。

將上述液體全部轉移到濾柱內，13000轉離心30S（可重復一次）。然后棄掉管內液體，向柱內加入500μL的WA Solution，13000轉離心30S。棄掉管內液體，再向柱內加入500μL的Wash Solution，13000轉離心30S（可重復一次）。然后空離3 min。將濾柱放置在一個新的1.5mL EP管中，室溫晾干。最后在柱子內加入35 μL的ddH2O，靜置5min，13000轉離心90s。為了提高回收率，可將溶解的DNA再次加入柱子內離心一分鐘。棄掉柱子，回收的即為擴增產物片段，并測定濃度。