“生活中，我們在漸漸死亡”。

實際上，在處理細胞實驗中，我們每做一個實驗，樣本中總是會有一些細胞死亡。這在有些檢測時可能不重要，但有些檢測中則非常麻煩。下面小編就來為大家介紹一下怎么用流式鑒別細胞死活

為什么要鑒別細胞死活

流式細胞術是一個容易被死細胞所干擾的技術，因為：

1. 死細胞容易攝取抗體和探針，導致明顯的非特異性染色。

2. 死細胞自發熒光特別強。

最后導致背景熒光增強，使得我們無法觀察到一些標記的弱陽性表達。

死細胞還可能會釋放DNA，DNA非常粘稠，所以最后會導致細胞成團，既影響結果，又容易堵塞管路。在流式分選中，一般都不愿意分選活力不好的細胞。

怎樣解決死細胞的問題

我們需要確保細胞的培養基中含少量DNAse，以保證細胞單個存在，不被死細胞產生的DNA影響而粘附在一起。

利用死細胞的一些特性來區分它們。當細胞死亡時，它們就會失去膜的完整性，膜的滲透性增強，這就是為什么我們在標記抗體時死細胞容易發生非特異性染色的緣故，但同時，我們也可以利用這個特性來幫助我們鑒別死細胞，目前有兩個方法-----使用DNA染料或蛋白染料。

DNA結合染料

PI、DAPI、7-AAD等DNA染料利用死細胞膜通透性增大、不破膜的情況下DNA染料即可進入的特點區分出死細胞，但所用染料濃度、時間遠遠低于細胞周期所用的濃度，并且不需要固定。

PI檢測通道：使用488 nm激發，用610/20 BP收集

DAPI檢測通道：最好用355nm激發，用440/40BP收集；也可以用405nm激發，450/50BP收集

7-AAD檢測通道：用488nm激發，用670/14BP收集

染色方法:

1. 用0.5mL 1×PBS重懸細胞。

2. 加入PI或DAPI或7-AAD，終濃度分別為PI（5 μg/mL）、DAPI（500-1000 ng/mL）、7-AAD（2.5 μM）

3. 加入上述染料后，盡快上機，一般不要超過5分鐘（有些廠家說明書寫著10分鐘，可能與濃度有關，可按照說明書操作）。

在上面的步驟中是把染料直接加入活細胞標本中。如果將PI等加入經過固定的細胞中會使所有的細胞都發生滲透性增高，結果就是所有的細胞都染上PI。在一些需要檢測胞內抗原而不得不破膜的標本中，這時就沒法用PI等DNA染料來區分死細胞了。

蛋白結合染料

蛋白結合染料有時候又被稱為胺類反應性染料或live/dead可固定染料。它們也是基于死細胞胞膜受損的原理，但略有不同，它們不是結合到DNA，而是結合到蛋白質，這類染料需要在固定前加入樣本中。活細胞由于細胞表面有少量蛋白，所以會結合少量的蛋白染料，而死細胞由于染料可以進入細胞內，能夠結合大量的胞內蛋白質，熒光會特別強。

染色完成之后，細胞就可以用多聚甲醛或乙醇等進行固定了，固定之前的死、活細胞之間的染色水平差異會一直保留著。這種染色方法也非常簡單，只需樣本和染料直接孵育20分鐘，而且這類染料的激發和發射特性也很多，所以能挑選到一種適合你實驗的熒光標記蛋白結合染料。