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QPCR原理以及數(shù)據(jù)處理

2024-01-05 14:09:57

來源/作者:普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺

 本文普拉特澤生物就給小白們從qPCR原理方法細細講講,梳理夯實一下基礎(chǔ)。
一、QPCR檢測原理

QPCR,即實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),是一種在生物醫(yī)學(xué)研究、分子診斷和基因表達分析等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的技術(shù)。其基本原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或者熒光標(biāo)記的特異性探針,通過在每個反應(yīng)循環(huán)中實時監(jiān)測熒光信號的增強,實現(xiàn)對起始模板的定量。

QPCR實驗

  qPCR的核心在于使用熒光染料或者探針,利用熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程。熒光染料通常與雙鏈DNA結(jié)合,隨著DNA的合成,熒光染料被釋放出來,產(chǎn)生熒光信號。而熒光標(biāo)記的特異性探針則通過與目標(biāo)序列結(jié)合,在PCR過程中被酶切,釋放出熒光信號。這兩種方式都能實現(xiàn)PCR反應(yīng)的實時監(jiān)測。

二、qPCR數(shù)據(jù)處理

①數(shù)據(jù)收集:

在qPCR實驗中,數(shù)據(jù)收集主要涉及記錄每次實驗的Ct值(閾值循環(huán)數(shù))。這些數(shù)據(jù)反映了樣本中目標(biāo)DNA片段的擴增情況。除了Ct值,實驗中其他重要的參數(shù),如樣本質(zhì)量、引物特異性等,也需要被詳細記錄。

②數(shù)據(jù)整理:

收集到的原始數(shù)據(jù)需要被整理成表格形式,便于后續(xù)分析。這些表格應(yīng)包括每個樣本的Ct值、任何與樣本質(zhì)量相關(guān)的信息(如DNA濃度)以及實驗的其他關(guān)鍵參數(shù)。

qPCR的疑難雜問解答

③數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化:

為了消除實驗中不同樣本間潛在的差異,如DNA濃度和PCR效率等,需要進行標(biāo)準(zhǔn)化處理。一種常見的方法是使用管家基因(housekeeping gene)進行標(biāo)準(zhǔn)化,因為這些基因在所有樣本中表達穩(wěn)定。標(biāo)準(zhǔn)化步驟是數(shù)據(jù)處理的關(guān)鍵環(huán)節(jié),能顯著提高數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性和可靠性。

④數(shù)據(jù)分析:

數(shù)據(jù)分析涉及對標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進行處理,以找出模式、趨勢和差異。常見的數(shù)據(jù)分析包括比較兩組或多組數(shù)據(jù)的均值、中位數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差等統(tǒng)計量,以及進行統(tǒng)計分析,如t檢驗、方差分析等。數(shù)據(jù)分析的目標(biāo)是揭示基因表達的潛在規(guī)律和差異。

⑤數(shù)據(jù)分析結(jié)果的解讀:

最后,解讀數(shù)據(jù)分析結(jié)果是一個關(guān)鍵步驟。結(jié)果解讀應(yīng)基于對實驗?zāi)康暮退芯可飳W(xué)過程的理解。在解讀結(jié)果時,應(yīng)關(guān)注顯著性差異、表達模式的一致性和差異性等方面。同時,應(yīng)注意排除可能的異常值和離群點,以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。


QPCR熔解曲線圖


⑥質(zhì)量控制和可重復(fù)性:

為了確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性,需要進行嚴(yán)格的質(zhì)量控制和重復(fù)實驗。質(zhì)量控制包括對實驗過程的監(jiān)控和對結(jié)果的驗證。此外,重復(fù)實驗有助于評估實驗的可靠性和可重復(fù)性。在數(shù)據(jù)處理過程中,應(yīng)剔除不符合質(zhì)量要求的實驗數(shù)據(jù),以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

qPCR技術(shù)以其獨特的優(yōu)勢在生物學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。了解其原理和數(shù)據(jù)處理方法對于準(zhǔn)確獲取實驗結(jié)果至關(guān)重要。通過不斷學(xué)習(xí)和實踐,我們將更好地掌握這一個技術(shù)。

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