【國自然熱點文獻分享】之表觀遺傳之泛素化-高分文章
2021-11-18 08:55:21
來源/作者：普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺
還是按著我們一貫的套路來學習和分享這篇泛素化的高分文獻~
這次分享的文獻題目是：CHIP-mediated CIB1 ubiquitination regulated epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis in lung adenocarcinoma，影響因子為15.820分，發表在Cell Death & Differentiation雜志上，發表時間為2020年10月，該文章主要探究了CHIP介導CIB1泛素化過程，從而調控肺腺癌的上皮-間質轉化和腫瘤的轉移。接下來通過作者得到的實驗結果來分析這篇文章吧!一、CIB1在肺腺癌中是一個促癌因子，跟不良預后呈正相關
從作者團隊前面的研究中得到36個有差異表達的膜蛋白結合數據庫分析篩選出CIB1作為研究對象。從ONCOMING數據庫分析得到，CIB1的表達顯著增高（Fig 1A），免疫組化檢測作者收集到的肺腺癌組織及相對應的正常組織中CIB1的蛋白水平，發現CIB1表達水平明顯增高，而且顯示表達主要在細胞質和細胞膜當中（Fig 1B），qPCR實驗檢測CIB1的mRNA水平，結果也與蛋白水平趨勢一致（Fig 1C），而且，CIB1在肺腺癌細胞中的mRNA及蛋白表達水平也顯著高于正常細胞（Fig 1D-E）。通過臨床分析發現，高表達的CIB1的病人的淋巴結轉移更加明顯,以及影響腫瘤分期（Fig 1F-G），而且，CIB1在腫瘤組織中高表達的患者的總生存期和無病生存期均短于低表達的患者（Fig 1H-I）。以上結果說明，CIB1在肺腺癌中高表達，并且與臨床特征和預后差密切相關。
二、體外實驗表明，CIB1可通過AKT途徑促進肺腺癌細胞遷移、侵襲能力，誘導EMT發生
首先，作者選用了兩株相對高表達CIB1（PC-9/H1437）以及兩株相對低表達CIB1的肺腺癌細胞株（A549/H1299），用于后續實驗。然后，在A549/H1299細胞株中過表達CIB1，結果發現，過表達CIB1之后，細胞的遷移和侵襲能力都大大增強了；相反，在PC-9/H1437細胞株中，敲低CIB1后，細胞的遷移和侵襲能力顯著受到抑制（Fig 2A-E）。已經有文獻表明， CIB1過表達可導致AKT的異常激活，從而促進腫瘤細胞的發育；而且AKT通路在多種致癌過程中發揮核心作用，如與EMT過程密切相關。因此，作者進一步檢測了與AKT通路和EMT過程相關蛋白的表達情況。結果表明，在肺腺癌細胞中，CIB1可以促進肺腺癌中AKT的磷酸化來激活AKT通路（Fig 2F）。CIB1下調后，EMT標記物N-cadherin、Vimentin表達下調，E-cadherin則表達上調，說明敲低CIB1后，抑制了肺腺癌細胞的EMT過程，而過表達CIB1，則促進了其EMT過程（Fig 2F）,同時，加入AKT通路的抑制劑（MK-2206）之后，過表達CIB1的細胞中的N-cadherin、Vimentin表達受到抑制，而E-cadherin表達增多，說明阻斷AKT通路后，EMT過程也被阻斷，而在敲低CIB1細胞不受其影響（Fig 2F）。以上結果說明，CIB1可通過AKT途徑促進肺腺癌細胞遷移、侵襲能力，誘導EMT發生。
三、CHIP可與CIB1相互作用并通過泛素-蛋白酶體途徑降低CIB1蛋白水平
為了鑒定與CIB1相互作用的蛋白，使用抗CIB1或IgG抗體進行免疫沉淀，然后使用LS-MS進行鑒定。相互作用的蛋白需滿足：在兩個LC-MS分析中，基于≥2個多肽以≥95%的置信度且平均比率變化≥1.5。根據上述條件，有38種蛋白被篩選出來（Fig 3A）。因為泛素-蛋白酶體系統與蛋白質的降解密切相關，因此選擇CHIP（E3泛素連接酶）用于后續的研究。采用CHIP實驗證實CHIP與CIB1之間能相互結合（Fig 3B）。免疫熒光檢測發現CHIP與CIB1在細胞質和細胞核中均有共同表達（Fig 3H）。在PC-9和HEK293細胞中過表達CHIP觀察到CIB1表達受到抑制(Fig 3C-D)；此外,在HEK293細胞中觀察到CHIP能以劑量依賴的方式降低CIB1（Fig 3G）。免疫組化染色顯示，60例患者中的CHIP在組織中低表達，與CIB1表達呈負相關（Fig 3E-F）。采用CHX測量CIB1的半衰期，發現CHIP降低了CIB1的穩定性（Fig 3I）。過表達Myc-CHIP可下調CIB1的蛋白水平，但MG-132(蛋白酶體抑制劑)干預后，CHIP下調CIB1的蛋白水平被逆轉。但是，用leupeptin（蛋白酶抑制劑）干預并不能逆轉（Fig 3J）。以上結果說明， CHIP誘導的CIB1蛋白水平下降依賴于泛素-蛋白酶體途徑。
四、CHIP通過泛素k48位點促進了CIB1的蛋白降解
前面作者已證實CHIP可能通過泛素化蛋白酶體途徑促進CIB1降解。那么是哪個泛素因子在其中起作用呢。作者通過一系列的蛋白互作實驗找到了關鍵因子。我們來一起看看吧。首先，作者過表達CHIP后用CIB1抗體沉淀CIB1蛋白，并用泛素抗體檢測，發現轉染CHIP的細胞中CIB1泛素化水平明顯高于轉染空白質粒的細胞（Figure 4A）。此外，當將flag-CIB1、HA泛素和Myc-CHIP過表達質粒共轉染到HEK293T細胞中時，flag-CIB1的泛素化水平顯著升高（Figure 4B）。接下來，作者構建了一個敲除CHIP的泛素連接酶結構域的CHIP-ΔUbox質粒。COIP實驗發現，CHIP-ΔUbox突變體不能增加CIB1的泛素化水平（Figure 4C-D）。此外，體外重組CHIP和CIB1的泛素化分析顯示，CHIP顯著增強了CIB1的泛素化水平（Figure 4F）。最后，分別將K48和K63轉移到HEK293細胞中。K48泛素突變后，CHIP介導的CIB1泛素化消失，而K63突變沒有變化（Figure 4E）。綜上，CHIP通過泛素的Lys-48殘基促進CIB1泛素化，從而調節CIB1的蛋白表達。
五、CHIP靶向CIB1的第10位和第65位賴氨酸進行泛素化
接下來作者進一步探索CIB1上的哪個賴氨酸可能是導致泛素化修飾的位點。先將CIB1上 的8個賴氨酸殘基（K10, K24, K65, K70, K83, K107, K150, K188）突變為鳥氨酸，與帶HA標簽的泛素共轉染HEK293T細胞。結果顯示，K10和K65賴氨酸突變后，CIB1的泛素化水平顯著降低（Figure 5A）。進一步研究發現，在K10和K65同時突變后，與單個突變相比，CIB1的泛素化水平顯著減少（Figure 5B）。同時，當K10和K65共突變為鳥氨酸時，CHIP過表達引起Flag-CIB1下調（Figure 5C）。綜上結果提示K10和K65可能是CIB1的泛素化位點。
六、CIB1受CHIP的負調控，影響肺腺癌細胞的體外轉移能力
前面的實驗確認了CIB1和CHIP間的相互關系，接下來就看看CHIP對CIB1介導的肺腺癌遷移和侵襲的影響。Transwell和劃痕實驗發現，過表達CIB1提高了肺腺癌細胞的轉移和侵襲能力，而CHIP的過表達可抑制由過表達CIB1誘導的轉移和侵襲能力，但CHIP-ΔUbox沒有產生相同的效果（Figure 6A-C）。此外，WB結果顯示CHIP/CIB1亦會影響P-AKT通路和上皮間質轉化因子的表達。CHIP的過表達可降低由CIB1誘導的p-AKT的表達。同時，CIB1可上調N-Cadherin和Vimentin，下調E-cadherin的表達，而CHIP的過表達可逆轉上述結果，但CHIP-ΔUbox不具有逆轉功能（Figure 6D）。上述結果說明，CIB1受CHIP負調控，影響肺腺癌細胞的轉移能力。七、CIB1受CHIP的負調控，并影響肺腺癌細胞的體內轉移能力
前面作者發現CHIP可以緩解CIB1誘導的LAC增強的體外遷移能力和轉移能力，接下來我們看看在體內是否可以觀察到同樣的結果。尾靜脈注射細胞后，發現與NC組相比，A549CIB1組小鼠轉移能力增強。此外，與A549CIB1/CHIP-ΔUbox相比，A549CIB1/CHIP組轉移能力降低（Figure 7A -C）。上述結論在HE和IHC實驗中亦得到了證實（Figure7D）。同時，在補充材料中，作者也發現下調CHIP表達能顯著提高CIB1過表達誘導的轉移能力。綜上，體內實驗亦證實CIB1可以被CHIP負調控，影響肺腺癌細胞的轉移能力。
結果到這里就已經全部分享完噠，相信各位閱讀的朋友們已經對這篇文獻的整體思路有了一個大概的了解。首先，作者通過他們前面的研究中篩選出CIB1這個蛋白作為研究目標，通過對臨床組織進行一系列實驗以及了解CIB1對肺腺癌的預后情況，再在細胞層面上過表達/敲除CIB1得到其對肺腺癌細胞功能學實驗的影響。其次，通過Co-IP和質譜篩選出與CIB1結合的蛋白CHIP，通過一系列實驗證明了CHIP可以通過泛素-降解途徑影響CIB1的表達，并得到泛素的K48以及CIB1的K10和K65位點參與CHIP對CIB1的表達。最后，采用回復實驗，在細胞層面和動物層面驗證CHIP對CIB1的調控關系。
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