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    染色質(zhì)免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）是研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的核心技術(shù)，廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、組蛋白修飾、表觀遺傳調(diào)控及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。

普拉特澤生物承接染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)等分子檢測(cè)相關(guān)服務(wù)上萬(wàn)例，積累了大量的操作經(jīng)驗(yàn)，還有超多的結(jié)果案例可供大家參考~還可以詳細(xì)解析ChIP實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（SOP）、關(guān)鍵優(yōu)化點(diǎn)及高級(jí)應(yīng)用，確保實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性和數(shù)據(jù)可靠性。

為大家詳細(xì)分享ChIP 實(shí)驗(yàn)操作步驟，同時(shí)為廣大科研工作者開(kāi)展線上的理論培訓(xùn)與線下實(shí)操，可承接ChIP 實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)。

ChIP實(shí)驗(yàn)原理與分類

1. 基本原理

ChIP通過(guò)甲醛交聯(lián)固定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，超聲或酶切破碎染色質(zhì)，利用特異性抗體富集目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA片段，最終通過(guò)PCR、qPCR或高通量測(cè)序（ChIP-seq）進(jìn)行定性和定量分析。

2. ChIP技術(shù)分類

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1. 關(guān)鍵試劑與設(shè)備

——細(xì)胞/組織樣本：1×10^6–10^7細(xì)胞/ChIP

——交聯(lián)試劑：37%甲醛（終濃度1%）、甘氨酸（終止液）

——裂解緩沖液：RIPA buffer（含蛋白酶抑制劑）

——抗體：ChIP級(jí)抗體（推薦Abcam、CST、Diagenode）

——磁珠：Protein A/G磁珠（Dynabeads?）

——片段化設(shè)備：Covaris超聲儀（推薦S220/Sonicator 3000）

——DNA純化試劑盒：Qiagen MinElute或Zymo DNA Clean & Concentrator

2. 抗體選擇與驗(yàn)證

抗體特異性驗(yàn)證：WB或IP驗(yàn)證靶蛋白結(jié)合能力

ChIP適用性驗(yàn)證：查閱ENCODE數(shù)據(jù)庫(kù)或已發(fā)表文獻(xiàn)

對(duì)照設(shè)置：

●陽(yáng)性對(duì)照：H3K27me3（異染色質(zhì)）、H3K4me3（活躍啟動(dòng)子）

●陰性對(duì)照：IgG同型對(duì)照

●Input對(duì)照：1%未免疫沉淀染色質(zhì)

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標(biāo)準(zhǔn)ChIP實(shí)驗(yàn)流程

1. 細(xì)胞交聯(lián)與染色質(zhì)制備

甲醛交聯(lián)：

細(xì)胞培養(yǎng)至80%匯合度，加入1%甲醛（終濃度），室溫交聯(lián)10min

加入125mM甘氨酸（終濃度）終止反應(yīng)5min

細(xì)胞裂解：

預(yù)冷PBS洗滌2次

加入含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液，冰上裂解10min

離心（4℃, 2000g, 5min）收集細(xì)胞核

2. 染色質(zhì)片段化

A. 超聲破碎（適用于X-ChIP）

推薦參數(shù)（Covaris S220）：

峰值功率：75W

占空比：5%

循環(huán)次數(shù)：200次

目標(biāo)片段大小：200–500bp（電泳驗(yàn)證）

B. MNase酶切（適用于N-ChIP）

37℃消化5–15min，EDTA終止反應(yīng)

電泳檢測(cè)單核小體（~147bp）

3. 免疫沉淀（IP）

預(yù)清除：加入Protein A/G磁珠，4℃孵育1h減少非特異性結(jié)合

抗體孵育：

取50–100μg染色質(zhì)，加入1–5μg抗體，4℃旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜

磁珠結(jié)合：

加入Protein A/G磁珠，4℃孵育2h

洗滌步驟（嚴(yán)格去除非特異結(jié)合）：

Low Salt Wash Buffer（1×）

High Salt Wash Buffer（1×）

LiCl Wash Buffer（1×）

TE Buffer（2×）

4. 交聯(lián)逆轉(zhuǎn)與DNA純化

交聯(lián)逆轉(zhuǎn)：

加入Elution Buffer（1% SDS, 0.1M NaHCO?），65℃孵育6h

蛋白酶消化：

加入RNase A（37℃ 30min）和Proteinase K（55℃ 1h）

DNA純化：

使用MinElute柱純化DNA，洗脫體積≤20μL

質(zhì)量控制（QC）與數(shù)據(jù)分析

1. 關(guān)鍵QC指標(biāo)

2. 下游分析技術(shù)

ChIP-qPCR：定量特定基因組位點(diǎn)（如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子）

ChIP-seq：全基因組結(jié)合位點(diǎn)分析（推薦Illumina NovaSeq）

CUT&Tag：低樣本量（500–50,000細(xì)胞）的高靈敏度替代方案

常見(jiàn)問(wèn)題與優(yōu)化策略

單細(xì)胞ChIP-seq（scChIP-seq）：研究細(xì)胞異質(zhì)性

CUT&RUN/CUT&Tag：無(wú)需交聯(lián)，適用于珍貴樣本

多組學(xué)整合分析：ChIP-seq + ATAC-seq + RNA-seq

ChIP實(shí)驗(yàn)的成功依賴于嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、抗體選擇和質(zhì)控步驟。建議初次實(shí)驗(yàn)者采用陽(yáng)性對(duì)照（如H3K27ac）優(yōu)化條件，并結(jié)合ChIP-seq驗(yàn)證全局結(jié)合譜。隨著技術(shù)進(jìn)步，CUT&Tag等新方法正逐步替代傳統(tǒng)ChIP，為低樣本量研究提供更高靈敏度解決方案。

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