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一、實驗目的

EdU檢測不同轉染處理對細胞增殖能力的影響。

二、實驗樣品

2.1 實驗樣本

備注：包括干預細胞用的相關試劑均按實驗樣品登記，每行登記一個或一組獨立樣品。

2.2 實驗參數

三、實驗結果

                     圖1：EdU熒光檢測示例圖

                                              圖2：熒光定量分析柱狀圖



四、實驗結論

  如圖所示，在CAL27細胞中，mimics NC和miR-23b-3p mimics組間無明顯差異，與inhibitorNC組相比，miR-23b-3p inhibitor組細胞增殖能力有所上調；SCC25細胞各組間無明顯差異。

請注意：因無法獲知研究背景及研究方案，我司提交的結果說明僅針對該次檢測結果進行客觀描述，所下結論僅供參考。請合理判斷該檢測結果的可用性。

五、實驗步驟

3.1 細胞復蘇 （如有）

(1)將ddH2O預溫至37℃。

(2)戴上手套和口罩帽子，從液氮罐中取出裝有目的細胞的凍存管（內有1 mL細胞混合液），立即投入37℃ ddH2O中，輕搖凍存管使之在1分鐘內快速溶解。

(3)完全溶解后，75%酒精擦拭凍存管外壁消毒后帶進超凈臺。

(4)在超凈臺中，在15 mL滅菌離心管中預先加入10 mL新鮮配制的培養基，打開凍存管，將所有凍融的細胞懸液加入該離心管中，常溫1000 rpm離心3分鐘，吸除上層的培養液。

(5)1 mL培養基重懸細胞沉淀，輕輕吹打混勻后加入T25細胞培養瓶中，補足培養基至5 mL，置于37℃、5% CO2培養箱培養。

(6)48小時后換液，細胞融合接近80%時即可傳代。

3.2 細胞鋪板及轉染 （如有）

取處于對數生長期，生長狀態良好的293T細胞用0.25%胰酶消化后，通過細胞計數計算后，按照密度為4×104個細胞/孔，種到24孔板中，鋪細胞18-24 h (盡量不要超過24小時，否則影響轉染效率)，細胞長至70～90%轉染（細胞密度過稀或者過密均會影響轉染效率），以24孔板為例：

(1) 將 1.6 μL LipoFiter /2 μL Lipo2000加入50 μLopti-mem Medium中,變成預混液1，室溫放置5 min。

(2) 將0.8 μg質粒/20 pmol目的片段加入到50 μL opti-mem Medium中混合，變成預混液2。

(3) 將質粒和 LipoFiter/Lipo2000混合（預混液1和預混液2進行混合），室溫放置20分鐘。

(4) 將24孔板里的完全培養基換成150 μL opti-mem Medium。

(5) 將轉染混合液緩慢加入到24孔板，輕輕前后晃動混勻。

(6) 37℃，5% CO2培養6 h后將培養基換成完全培養基。

3.3 EdU檢測實驗步驟

EdU 標記：

（1）用細胞完全培養基按比例稀釋EdU溶液，制備適量2×EdU 工作液，終濃度為50μM； 

（2）每孔加入37°水浴的 EdU 工作液液500μL和500μL培養基（1比1），混合均勻后于培養箱孵育6-7小時（可根據細胞增殖速度，適當調整孵育時間），使EdU終濃度為50 μM ； 

（3）棄孵育培養基，PBS（含3%BSA，以下PBS表示）清洗細胞3次，每次5分鐘。 

細胞固定及通透：

（1）每孔加入1 mL細胞固定液 (即含4%多聚甲醛的 PBS)室溫孵育15分鐘，棄固定液；  

（2）每孔加入PBS，清洗3次，每次5分鐘；

（3）每孔加入1 mL滲透劑(0.3% TritonX-100的PBS)室溫孵育15分鐘；PBS清洗3次，每次5分鐘

EdU檢測：

（1）每孔加入0.2 ml Click反應混合液，輕輕搖晃培養板以確保反應混合物可以均勻覆蓋樣品，體系按需配置；避光反應1-2小時；

（2）吸除Click反應液，用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘；  

DNA 染色：

（1） DAPI溶液的配制：按1:1000比例用PBS稀釋DAPI (1000X），避光保存； 

（2） 每孔加1X DAPI溶液1ml，室溫避光孵育10分鐘左右；

（3）每孔加入PBS 清洗 1~3 次；

（4）采圖。

五、熒光定量分析數據



注：組化定量分析采用image pro plus 6.0軟件，IOD值為圖片上各點光密度值的累加，此值與目標物質的總量成正比；IOD值除以目標分布區域的面積，得到平均density,此值反映了目標物質的單位面積濃度。對樣品照片進行數字圖像分析比較時，就是比較他們之間的平均光密度值的大小。

單位為a.u.(arbitrary unit)，是無量綱單位

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