ELISA實驗注意事項
2024-09-06 15:43:46
來源/作者：普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺
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ELISA（酶聯免疫吸附試驗）是一種常用的生物化學檢測技術，廣泛應用于醫學、生物學、食品科學等領域。由于ELISA實驗過程復雜且對條件要求嚴格，因此在進行實驗時需要注意多個方面以確保結果的準確性和可靠性。以下是ELISA實驗過程中需要特別注意的幾個方面。
一、實驗前準備
1. 試劑檢查與配制
①試劑檢查：實驗前務必對試劑盒進行仔細檢查，包括生產日期、批號、有效期等，確保試劑盒在有效期內使用。
②試劑配制：嚴格按照試劑盒說明書進行試劑配制，包括抗體、酶標抗體、底物等，避免出現濃度誤差或污染。配制好的試劑應存放于4℃冰箱中，并盡快使用，避免反復凍融。
2. 實驗器材準備
①移液槍：保證移液槍的準確性，誤差不能超過2%。可用水和電子天平進行確定，但最好有專業人員進行矯正。
②槍頭：要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后，要更換槍頭，即使是吸取標準品時也要更換，以避免交叉污染。
3. 試劑盒及樣本處理
①試劑盒取出：在實驗前1小時將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復到室溫，以使結果更穩定。
②樣本處理：待檢樣品要澄清，避免渾濁或懸浮物影響實驗結果。對于細胞培養上清、血清、血漿等樣本，需要按照規定的方法進行收集和保存，確保樣本的新鮮度和活 性。
二、實驗過程注意事項
1. 液體吸取與加樣
速度控制：用槍吸取液體時速度不能太快，以免產生氣泡而使吸取量不準確。
量程選擇：吸取液體時，要用量程和需要量接近的槍去吸，以減少誤差。
加樣操作：將液體加到酶標孔中時，避免槍頭和孔內液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會自然流下去。
2. 孵育與溫浴
孵育條件：震蕩孵育可以加快抗原抗體之間的相互接觸，使反應更加充分。水浴溫度應保持在37℃，且水浴需要封閉以防止污染。
溫浴時間：溫浴時間應嚴格遵守試劑盒規定，以確保反應充分進行。
3. 洗板與顯色
洗板操作：洗板時，每次洗液加入后，應靜置1-2分鐘，使清洗更加徹底。沒有洗板機時，倒去液體后，要將酶標板在報紙或毛紙上用力拍干。
顯色控制：顯色需控制好時間，根據說明書操作。時間過短會導致結果偏低，時間過長則可能導致空白增高或非特異性顯色增加。
4. 底物與終止液
底物配制：底物是光敏感的，要在臨用前現配，避免長時間光照導致失效。
毒性防護：底物有一定的毒性，終止液對皮膚有腐蝕性，應盡量避免接觸。
三、實驗后處理與數據分析
1. 酶標儀使用
①預熱：檢測前，要打開酶標儀，使之穩定10分鐘以上，以獲得更穩定的結果。
②波長選擇：在讀數過程中，應選擇適宜的波長和時間進行檢測，并使用配套的儀器設備進行數據分析。
2. 數據處理與驗證
①雙孔實驗：應盡量做雙孔實驗，以保證數據的準確性。
②結果驗證：對結果有疑問的樣品要用其它方法進行確證，以確保結果的可靠性。
四、總結
ELISA實驗過程復雜且對條件要求嚴格，因此在進行實驗時需要注意多個方面。從實驗前的試劑檢查、器材準備到實驗過程中的液體吸取、孵育、洗板、顯色等環節，都需要嚴格遵守操作規程和注意事項。只有這樣，才能確保實驗結果的準確性和可靠性，為科學研究和臨床應用提供有力的支持。
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