非酒精性脂肪肝（NASH）小鼠模型關鍵指標檢測指南：肝重比、ALT、TG的標準化實驗方法
2025-04-11 16:36:20
來源/作者：普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺
非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是NAFLD的進展階段，表現為肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化。在NASH小鼠模型研究中，肝重比（Liver/Body Weight Ratio）、血清ALT（丙氨酸氨基轉移酶）、肝臟TG（甘油三酯）是評估疾病進展的核心指標。
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1. 肝重比（Liver/Body Weight Ratio）檢測
意義：評估肝臟腫大程度，反映脂肪沉積和炎癥程度。
實驗步驟
●小鼠稱重：禁食4-6小時后，稱量小鼠體重（g）。
●肝臟摘取：安樂死后迅速取出完整肝臟，用預冷PBS沖洗血跡，濾紙吸干表面水分。
●稱肝重：精確稱量肝臟濕重（g）。
計算肝重比：
注意事項
?標準化操作：所有小鼠禁食時間一致，避免食物影響肝臟重量。
? 快速取材：肝臟離體后易失水，需在10分鐘內完成稱重。
?排除異常樣本：若肝臟有肉眼可見腫瘤或嚴重壞死，需記錄并剔除。
2. 血清ALT（丙氨酸氨基轉移酶）檢測
意義：ALT是肝損傷的關鍵標志物，NASH模型中ALT升高提示肝細胞損傷。
●實驗方法
（1）采血與血清制備
眼眶取血/心臟穿刺：收集全血至EP管，室溫靜置30分鐘。
離心分離血清：4℃、3000 rpm離心15分鐘，取上清（避免溶血）。
（2）ALT檢測（推薦試劑盒法）
原理：ALT催化丙氨酸和α-酮戊二酸反應生成丙酮酸，通過檢測NADH吸光度變化（340 nm）計算酶活性。
步驟：按試劑盒（如碧云天ALT檢測試劑盒）說明書操作，通常包括：
1.配制反應混合液
2.加入血清樣本
3.酶標儀測定OD值
4.根據標準曲線計算ALT濃度（U/L）
常見問題與優化
溶血影響：紅細胞破裂會釋放ALT，導致假陽性，需輕柔操作避免溶血。
樣本保存：血清4℃可存24小時，-80℃長期保存（避免反復凍融）。
3. 肝臟TG（甘油三酯）檢測
意義：TG沉積是NASH的核心特征，定量TG可評估脂肪變性程度。
?實驗流程
（1）肝臟樣本處理
組織勻漿：取50-100 mg肝組織，加入1 mL異丙醇（或氯仿:甲醇=2:1），勻漿器冰上破碎。
離心提取脂質：12,000 rpm、4℃離心10分鐘，取上清。
（2）TG測定（推薦GPO-PAP法）
原理：甘油三酯被脂蛋白脂肪酶水解為甘油，經酶偶聯反應生成醌亞胺，在546 nm測吸光度。
步驟（以南京建成試劑盒為例）：
配制工作液
①加入樣本和標準品
②37℃孵育10分鐘
③酶標儀檢測，計算TG含量（mmol/g蛋白或mg/g組織）
關鍵注意事項
⒈標準化取樣：同一肝葉位置（如左葉）取樣，避免區域差異。
⒉校正總蛋白：建議用BCA法測勻漿總蛋白，以mmol/mg蛋白為單位更準確。
4. 數據解讀與NASH模型驗證
⒈肝重比：NASH小鼠通常＞5%（正常小鼠約4%）。
⒉ALT：NASH模型ALT＞50 U/L（正常＜30 U/L）。
⒊TG：高脂飲食模型TG可達正常肝的3-5倍。
建議結合其他指標：
組織學（HE染色觀察脂肪變性、天狼星紅染色評估纖維化）
炎癥因子（TNF-α、IL-6 ELISA）
5. 實驗優化與FAQ
Q：ALT檢測為何要用空腹血清？
→ A：進食后脂血可能干擾吸光度檢測。
Q：TG提取用異丙醇還是氯仿-甲醇？
→ A：異丙醇更安全，但氯仿-甲醇提取效率更高（需通風櫥操作）。
Q：肝重比異常高可能原因？
→ A：除脂肪沉積外，需排除肝臟充血、腫瘤或采樣誤差。
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