上月的文獻(xiàn)學(xué)習(xí)，我們梳理了一篇影響因子7分左右的關(guān)于乙酰化的SCI，文章涉及乙酰化研究的實(shí)驗(yàn)不多，是不是意猶未盡呢？今天，我們一起來(lái)看看影響因子16左右的文章怎么研究乙酰化的吧~
這次分享的文獻(xiàn)題目是：KAT6A Acetylation of SMAD3 Regulates Myeloid-Derived Suppressor Cell Recruitment, Metastasis, and Immunotherapy in Triple-Negative Breast Cancer，影響因子為16.803分，兩個(gè)月前才熱乎乎的發(fā)表在Adv Sci雜志上。
想了解高分文章是怎么研究乙酰化的伙伴們，現(xiàn)在就跟著我，踏著之前文獻(xiàn)解讀的“標(biāo)準(zhǔn)步驟”往下看吧~
一、KAT6A的過(guò)表達(dá)與三陰性乳腺癌（TNBC）轉(zhuǎn)移相關(guān)
為了確定KAT6A在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用，作者首先用METABRIC dataset 分析了16個(gè)賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（KAT）基因DNA拷貝數(shù)的改變情況。結(jié)果顯示，KAT基因在TNBC中表現(xiàn)出不同程度的拷貝數(shù)擴(kuò)增，而KAT6A拷貝數(shù)擴(kuò)增最多（Figure 1A）。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)KAT6A擴(kuò)增拷貝數(shù)高的TNBC患者，總生存期更差（Figure 1B）。此外，高表達(dá)的KAT6A亦與無(wú)復(fù)發(fā)生存率的降低顯著相關(guān)（Figure 1C）。接下來(lái)的免疫組化結(jié)果顯示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的TNBC腫瘤KAT6A表達(dá)明顯高于無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移的TNBC（Figure 1C-1D）。與原發(fā)性TNBC腫瘤相比，KAT6A在淋巴結(jié)和肺轉(zhuǎn)移中均顯著上調(diào)（Figure 1F）。細(xì)胞水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與MCF-10A細(xì)胞相比，KAT6A在所有檢測(cè)的乳腺癌細(xì)胞中都有高表達(dá)，具有高轉(zhuǎn)移能力的TNBC細(xì)胞中KAT6A蛋白水平高于非轉(zhuǎn)移細(xì)胞（Figure 1G）。在MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞中敲低KAT6A（Figure 1H）顯著降低了細(xì)胞的增殖能力（補(bǔ)充材料），侵襲和遷移能力（Figure 1I - 1J）以及原位異種移植瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力（Figure 1K-1L）。同時(shí)，KAT6A的敲低亦可顯著抑制轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)的形成（Figure 1M- 1N）、延長(zhǎng)動(dòng)物的生存期（Figure 1O）。這些數(shù)據(jù)表明，KAT6A對(duì)TNBC轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，KAT6A高表達(dá)的患者預(yù)后較差。二、KAT6A使SMAD3在Lys20和Lys117發(fā)生乙酰化
為了探索KAT6A在乳腺癌轉(zhuǎn)移中調(diào)控的下游靶點(diǎn)，作者從MDA-MB-231細(xì)胞中純化了flag標(biāo)記的KAT6A復(fù)合物，并進(jìn)行MS分析。在鑒定出KAT6A可結(jié)合蛋白中，SMAD3高度富集（Figure 2A）。外源性以及內(nèi)源性Co-IP分析均證實(shí)KAT6A與SMAD3的存在相互作用（Figure 2B-2C）。GST pulldown實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)純化的重組KAT6A可直接與SMAD3相互作用，TGF-β1的刺激顯著增強(qiáng)KAT6A-SMAD3的關(guān)聯(lián)（Figure 2D）。在HEK293T細(xì)胞中，KAT6A與野生型SMAD3或缺失突變體SMAD3共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：SMAD3的c端MH2結(jié)構(gòu)域（氨基酸232-425）是與KAT6A關(guān)聯(lián)所必需的（Figure 2E-2F）。接下來(lái)，作者評(píng)估了KAT6A 敲低對(duì)SMAD3乙酰化的影響。TGF-β1激活SMAD3的乙酰化（Figure 2G），而KAT6A的敲低減弱了TGF-β1誘導(dǎo)的SMAD3乙酰化（Figure 2H）。與野生型 KAT6A相比，KAT6A乙酰轉(zhuǎn)移酶活性缺陷突變體G657E或C543G/G657E顯著減弱了SMAD3的乙酰化（Figure 2I）。
質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)SMAD3 MH1區(qū)域賴氨酸20（K20）和賴氨酸117（K117）發(fā)生乙酰化，同時(shí)，這兩個(gè)殘基在不同物種間高度保守（Figure 2J）。在TGF-β1刺激下，賴氨酸到精氨酸的突變降低KAT6A誘導(dǎo)的SMAD3乙酰化，而賴氨酸和精氨酸的同時(shí)突變消除SMAD3的乙酰化（Figure 2K）。使用純化的重組活性KAT6A和重組WT SMAD3或K20R或K117R突變體進(jìn)行體外KAT實(shí)驗(yàn)證實(shí)KAT6A對(duì)K20和K117的乙酰化（Figure 2L）。此外，與WT SMAD3相比，乙酰化模擬K20/117Q突變體增強(qiáng)了SMAD3與KAT6A的關(guān)聯(lián)，而非乙酰化K20/117R突變體抑制了它們的相互作用（Figure 2M）。
因此，這些數(shù)據(jù)表明，KAT6A可以直接乙酰化SMAD3的K20和K117殘基。
三、SMAD3的K20/K117乙酰化上調(diào)免疫反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子
鑒于SMAD3是一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，作者假設(shè)SMAD3的K20/K117乙酰化增強(qiáng)了其轉(zhuǎn)錄活性。為驗(yàn)證這一假設(shè)，在MDA-MB-231/sgSMAD3細(xì)胞中進(jìn)行了RNA-Seq，這些細(xì)胞過(guò)表達(dá)Flag-SMAD3 WT或精氨酸賴氨酸共同突變體（2KQ突變體）。測(cè)序分析出554個(gè)在2KQ突變體組高表達(dá)的基因（Figure 3A）。這554個(gè)基因在與炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路中高度富集（Figure 3B）。接下來(lái)，結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，作者篩選出無(wú)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的TNBC患者樣本中高表達(dá)的14個(gè)基因（Figure 3C）。基因集富集分析顯示，KAT6A乙酰化的SMAD3（SMAD3-2KQ）上調(diào)炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)的（IL-6、IL-22和TNFα）信號(hào)通路（Figure 3D）。此外，QPCR分析發(fā)現(xiàn)，2KQ突變體促進(jìn)了MDA-MB-231/sgSMAD3和BT-549/sgSMAD3細(xì)胞中IL-6、IL-22和TNFα的表達(dá)和分泌（Figure 3E-3F）。補(bǔ)充材料中，與SMAD3-WT相比，SMAD3-2KQ突變體顯著提高了IL-6、IL-22和TNFA啟動(dòng)子的活性。ChIP-qPCR分析發(fā)現(xiàn)MDA-MB和BT-249細(xì)胞中SMAD3可與IL-6、IL-22和TNFA啟動(dòng)子結(jié)合。TGF-β1刺激確實(shí)可以以KAT6A依賴的方式導(dǎo)致這些細(xì)胞因子表達(dá)的增加。綜上，SMAD3的K20/K117乙酰化上調(diào)免疫應(yīng)答相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。四、SMAD3K的20/117位點(diǎn)乙酰化后能增加與KAT6A介導(dǎo)的TRIM24閱讀蛋白的H3K23乙酰化，從而增強(qiáng)SMAD3的活性
文獻(xiàn)表明，TRIM24是TRIM超家族中TRIM33相關(guān)的輔助因子，也是KAT6A介導(dǎo)的H3K23ac在癌癥中的閱讀蛋白。因此作者研究了K20/117乙酰化是否能影響SMAD3與TRIM33和/或TRIM24的結(jié)合作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1刺激的MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞中，TRIM24和TRIM33均與SMAD3結(jié)合（Figure 4A-B），且過(guò)表達(dá)TRIM24后，其與SMAD3的結(jié)合增強(qiáng)了，而TRIM33與SMAD3的結(jié)合卻遭到了破壞（Figure 4A）。另外發(fā)現(xiàn)，除了SMAD3之外，SMAD2和SMAD4與TRIM24沒(méi)有特異性關(guān)聯(lián)（Figure 4C）。此外，通過(guò)補(bǔ)充材料說(shuō)明TRIM24蛋白的中間段的393-823氨基酸殘基介導(dǎo)了與SMAD3的結(jié)合。過(guò)表達(dá)TRIM33后發(fā)現(xiàn)SMAD3-TRIM24的相互結(jié)合作用減少。以上結(jié)果說(shuō)明TRIM24和TRIM33競(jìng)爭(zhēng)性與TGF-β1激活的SMAD3蛋白相結(jié)合。接下來(lái)，作者探索K20/117乙酰化對(duì)SMAD3與TRIM24和TRIM33結(jié)合的影響。與野生型SMAD3相比，乙酰化擬合2KQ突變體增強(qiáng)了TRIM24-SMAD3的相互作用，抑制了TRIM33與SMAD3的結(jié)合。而乙酰化缺失的2KQ突變體則得到了相反的結(jié)果（Figure 4D-4E）。2KQ突變體異位表達(dá)增加了IL-6、IL-22和TGF-β1的蛋白表達(dá)（Figure 4E）。以上結(jié)果表明，SMAD3的乙酰化促進(jìn)了其與致癌基因TRIM24的相互作用，并降低了其與TRIM33腫瘤抑制因子的結(jié)合，從而增強(qiáng)了SMAD3的致癌活性。作者通過(guò)文獻(xiàn)得到假設(shè)：KAT6A乙酰化H3K23招募TRIM24-SMAD3復(fù)合物，增強(qiáng)SMAD3-染色質(zhì)相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致乳腺癌中SMAD3活化增強(qiáng)。首先，作者采用TRIM24 F979A/N980A的突變體破壞了TRIM24-H3K23ac的交互作用，但對(duì)TRIM24與SMAD3的相關(guān)性沒(méi)有影響（Figure 4F）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，共表達(dá)HA-tagged的SMAD3 WT、2KQ或2KR突變體與WT TRIM24 F979A/N980A突變體。結(jié)果得到，與WT TRIM24相比，F(xiàn)979A/N980A突變降低H3K23ac與TRIM24以及SMAD3 WT和突變體的關(guān)聯(lián)（Figure 4G），也降低了SMAD3 WT和2KQ突變體與IL-6、IL-22和TNFα啟動(dòng)子的結(jié)合作用, 從而抑制IL-6、IL-22和TNF-β1的表達(dá)（Figure 4H-4I）。與SMAD3 WT與F979A/N980A突變共轉(zhuǎn)染組相比，2KQ突變顯著增加其與IL-6、IL-22和TNFA啟動(dòng)子的結(jié)合以及增強(qiáng)IL-6、IL-22和TNFA的表達(dá)（Figure 4H-I）。這些結(jié)果表明SMAD3 2KQ突變?cè)黾覫L-6、IL-22和TNFA的表達(dá)與H3K23ac沒(méi)有相關(guān)性，但H3K23ac結(jié)合能進(jìn)一步增加SMAD3 2KQ突變體的活性。綜上，KAT6A乙酰化SMAD3促進(jìn)了SMAD3與H3K23ac閱讀器TRIM24的結(jié)合，KAT6A介導(dǎo)的H3K23ac進(jìn)一步增加了TRIM24/SMAD3-染色質(zhì)關(guān)聯(lián)，從而導(dǎo)致SMAD3信號(hào)激活增強(qiáng)。五、SMAD3的K20/K117乙酰化通過(guò)增強(qiáng)CSC和MDSCs招募促進(jìn)TNBC的轉(zhuǎn)移
以上結(jié)果提示，KAT6A/SMAD3軸可能影響TNBC中的乳腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞（BCSC）特性。dox誘導(dǎo)KAT6A的敲降降低了IL-6、IL-22和TNFα 的蛋白表達(dá)、p-STAT3、CSC相關(guān)蛋白SOX2和CD44的表達(dá)、ALDH +亞種群、細(xì)胞成球能力（Figure 5A-5D）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果能被擬乙酰化SMAD3的異位表達(dá)的2KQ突變體所逆轉(zhuǎn)（Figure 5A-5D）。此外，與對(duì)照組相比，KAT6A KD增加了E-cadherin的表達(dá)，降低了N-cadherin、ZEB1、Slug和Snail的表達(dá)，但在擬乙酰化SMAD3的異位表達(dá)的2KQ突變體組中未觀察到此變化趨勢(shì)（補(bǔ)充材料）。綜上，KAT6A-SMAD3軸能促進(jìn)TNBC中的BCSC特性。為了研究KAT6A依賴SMAD3乙酰化對(duì)TNBC轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用，作者在有或沒(méi)有KAT6A KD的4T1/sgSmad3細(xì)胞中表達(dá)Flag-SMAD3 WT和2KR突變體，從IL-6，IL-22，TNFα的表達(dá)、細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、MDSCs招募、肺的微小轉(zhuǎn)移等方面說(shuō)明（補(bǔ)充材料）KAT6A誘導(dǎo)的SMAD3乙酰化能促進(jìn)TNBC的轉(zhuǎn)移。接下來(lái)，作者利用4T1小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移模型，研究SMAD3乙酰化對(duì)體內(nèi)MDSCs招募的影響。與未誘導(dǎo)細(xì)胞相比，dox誘導(dǎo)的KAT6A KD降低了IL-6、IL-22和TNFα、p-STAT3的表達(dá)（Figure 5E），KAT6A KD抑制腫瘤生長(zhǎng)、肺轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)小鼠存活期（Figure 5F-5J），抑制MDSCs向轉(zhuǎn)移性肺組織和原位瘤的募集以及轉(zhuǎn)移性肺組織CD4+/CD8+ T細(xì)胞耗竭（Figure 5F-5M+補(bǔ)充材料）。以上結(jié)果均能被乙酰化模擬SMAD3 2KQ突變體所逆轉(zhuǎn)（Figure 5E-5M）。故，KAT6A依賴SMAD3乙酰化通過(guò)MDSCs招募促進(jìn)TNBC轉(zhuǎn)移。為了進(jìn)一步證明乳腺癌細(xì)胞分泌的促炎因子在SMAD3介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，作者構(gòu)建了IL-6 KO 4T1細(xì)胞并發(fā)現(xiàn)IL-6 KO抑制了SMAD3-2KQ誘導(dǎo)的MDSCs募集（補(bǔ)充材料）。并在體內(nèi)SMAD3-2KQ-誘導(dǎo)的MDSCs招募實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)（補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)）。以上結(jié)果說(shuō)明促炎因子IL-6亦參與SMAD3介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移中過(guò)程。綜上，KAT6A誘導(dǎo)的SMAD3乙酰化不僅增強(qiáng)乳腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞特性，同時(shí)通過(guò)持續(xù)產(chǎn)生免疫應(yīng)答相關(guān)細(xì)胞因子誘導(dǎo)MDSCs招募，促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展。<section sty
2022-02-28 15:34:03
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