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前段時間居然有患者來咨詢我們：

免疫組化是否能用于分辨腫瘤是良性還是惡性。

雖然我們可以做免疫組化實驗（而且做得很好），但如果病患想通過免疫組化鑒別腫瘤，來出具具有司法效應的診斷報告。交給不具備司法權限的任何機構來做是不可行的喲~

事實上，免疫組化在醫學上用于檢測人體組織或細胞標本，確實可鑒別疾病或腫瘤。進而評估增生細胞來源，檢測其克隆性，研究腫瘤組織代謝改變，讓腫瘤組織在顯微鏡下原形畢露，從而達到對某些腫瘤有確診和指導治療的作用。

免疫組化技術不僅在臨床檢測上有重要的作用，在科研實驗和論文中也是一個得力好助手哦。下面我們就來好好了解一下免疫組化有關的知識吧。

免疫組織化學(Immunohistochemistry,簡稱IHC)，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項技術。

臨床應用：

1. 鑒定病變性質，惡性腫瘤的診斷和鑒別；

2. 確定轉移性惡性腫瘤的原發部位；

3. 了解腫瘤的分化程度，對某類腫瘤進行病理分型；

4. 明確軟組織腫瘤的正確組織學分類，明確軟組織的診斷；

5. 發現微小轉移灶；

6. 為臨床治療方案提供支持。

我們先來看一下實驗操作有哪幾步

首先，脫蠟與水化

目的是確保抗體等其他試劑能夠充分與組織中抗原等結合發生反應，

若脫蠟和水化不全，易出現局灶性反應和浸洗不全，而造成非特異性背景著色；

封閉內源性過氧化物酶

主要目的是降低內源性過氧化物酶活性，要知道，在傳統的ABC法和SP法中，IHC反應結果容易受到內源性過氧化物酶干擾，所以必須用過氧化氫進行滅活；

具體操作如下：

1. 放入3%過氧化氫水溶液中，室溫下10min；

2. PBS溶液洗2次x5 min或者PBS溶液洗3次x3 min

抗原修復

目的是暴露抗原決定簇，

因為組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發生了蛋白之間交聯和醛基的封閉作用，從而失去抗原性，因而需要通過抗原修復，使細胞內抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。

常用修復方法（由強到弱）：高壓修復＞微波修復＞胰酶修復

封閉特異性蛋白

目的是避免組織切片上剩余某些位點與一抗非特異性結合，避免因此造成結果出現假陽性；

注意：封閉血清一般是和二抗同一來源的。

一抗孵育

一抗可以通過特異性結合底物，識別出我們想要檢測的東西

一般4℃過夜和從冰箱拿出37℃復溫45min。

一是防止脫片；

二是使抗原抗體結合更穩定；

具體條件還在做更多地摸索。

二抗孵育

作用是檢測一抗。二抗可以和一抗結合，并帶有可以被檢測出的標記（如帶熒光、放射性、化學發光或顯色基因）

二抗孵育條件：一般室溫或37℃下孵育20min~1h，具體時間還在做更多地摸索。

實驗過程中我們通常先把二抗濃度和孵育時間先定下，然后摸索一抗濃度和孵育時間。

SP反應

SP染色法即鏈霉素抗生物素過氧化酶連接法，為后面的顯色做準備。

顯色

在免疫組化中，因為抗原抗體所形成的復合物本身沒有顏色不能直接觀察，只能借助于其他某些化學基團的顯色作用使復合物顯色，有利于顯微鏡下觀察。

而通常在過氧化物酶（HRP）法中，顯色劑為DAB。

復染、脫水、透明、封片

復染目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位，常用試劑為蘇木素。復染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數秒（注意動作一定要快），之后拿出繼續流水振洗，放入氨水中返藍即可。

封片用中性樹膠。

所謂“細節決定成敗”，IHC的實驗流程并不難，但是過程中容易遇到各種問題，要做出漂亮的實驗結果也不是一件容易的事，接下來我們來看看實驗結果通常反映出來的問題有哪些，如何判斷呢？

IHC染色常見問題

1. 所有切片呈陰性反應：

a. 緩沖液內含疊氮化鈉，抑制酶的活性；

b. 染色未完全按照操作步驟進行；

c. 漏加一種抗體或抗體失活；

d. 復染或脫水劑使用不當；

e. 底物中加入的過氧化氫少或失活。

2. 所有切片呈陽性反應：

a. 緩沖液配置中未加氯化鈉和PH值不準確，洗滌不徹底；

b. 使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反應時間過長；

c. 過氧化氫濃度過高，呈色速度過快且粘附劑太厚；

d. 切片在染色過程中抗體過濃，或干片了；

e. 抗體孵育的時間過長。

3. 切片背景過深：

a. 漂洗不夠；

b. 切片或涂片過厚；

c. 蛋白質封閉不夠或所用血清溶血；

d. 使用全血清抗體稀釋不夠；

e. 底物成色反應過久。

4. 陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應：

以上問題就需要我們抓好平時實驗操作的每一步，尤其是注意事項，避免出現不必要的變量影響實驗結果。

歡迎各位有實驗外包需要的老師們前來咨詢哦~