酵母單雜交實驗詳細步驟【酵母單雜外包】
2022-09-16 14:49:20
來源/作者：普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺
酵母單雜交實驗步驟由普拉特澤生物總結分享。酵母單雜交(Yeast one-hybrid)是根據DNA結合蛋白(即轉錄因子)與DNA順式作用元件結合調控報告基因表達的原理，克隆與靶元件特異結合的轉錄因子基因(cDNA)的有效方法。普拉特澤生物——分子檢測平臺專業承接酵母單雜實驗外包服務，總結了一套常用的酵母單雜實驗步驟，一起來學習吧！
一、構建誘餌菌株
1、制備YM4271感受態細胞
2、取上述感受態菌液，與1μg pHisi-cor promoter質粒混勻后加入預冷為0.2cm（electrode gap）電擊轉化杯（cuvette）中，置于冰上3min；
3、設置BTX電轉儀的參數進行電轉化（高壓脈沖1.8kV）5ms；
4、吸出菌液后涂布至SD/ Ura-平板，正置1小時，然后28℃倒置培養2-5天，待其長出明顯的單菌落。
5、從平板上挑取單克隆落接種到2mL的液體SD/ Ura-中，30℃振蕩培養過夜OD600達0.6-1.0。
二、自激活驗證
1、以上步擴大培養的菌株，進行感受態細胞制備
2、取該感受態菌液，與1μg pGADT7 AD質粒混勻后加入預冷為0.2cm（electrode gap）電擊轉化杯（cuvette）中，置于冰上3min；
3、設置BTX電轉儀的參數進行電轉化（高壓脈沖1.8kV）5ms；
4、吸出菌液后涂布至SD/ Ura-Leu-平板，正置1小時，然后28℃倒置培養2-5天，待其長出明顯的單菌落。
5、從平板上挑取單克隆落接種到2mL的液體SD/ Ura-Leu-中，30℃振蕩培養過夜OD600達0.6-1.0。
6、配制含有不同濃度3-AT的SD/ Ura-Leu-平板，濃度設置為10，15，20，50ug/ml。
7、按照五個稀釋梯度，每滴2ul進行酵母點菌實驗，28℃倒置培養3天，發現以上4個 3-AT濃度梯度下，均無菌落生長，選擇5ug/ml 3-AT作為后續互作驗證篩選濃度。
三、轉化誘餌菌株
1、以步驟1中擴大培養的cor promoter誘餌菌株，進行感受態細胞制備
2、取該感受態菌液，與1μg pGADT7-bHLH3質粒混勻后加入預冷為0.2cm（electrode gap）電擊轉化杯（cuvette）中，置于冰上3min；
3、設置BTX電轉儀的參數進行電轉化（高壓脈沖1.8kV）5ms；
4、吸出菌液后涂布至SD/ Ura-Leu-平板，正置1小時，然后28℃倒置培養2-5天，待其長出明顯的單菌落。
5、從平板上挑取單克隆落接種到2mL的液體SD/ Ura-Leu-中，30℃振蕩培養過夜OD600達0.6-1.0。
相同方法轉化cor promoter mutant誘餌菌株和jaz3 promoter誘餌菌株。
四、陽性對照酵母YM4271/pGADT7-P53/SV40復蘇
1、取凍存的酵母YM4271/pGADT7-P53/SV40細胞，用接菌環在融化的菌液表面蘸一下，在SD/-Leu固體平板上劃線，30℃倒置培養2天；
2、從平板上挑取單克隆落接種到液體SD/-Leu中，30℃振蕩培養過夜至OD600達0.8
五、陰性對照酵母YM4271/pGADT7-lam/SV40復蘇
1、取凍存的酵母YM4271/pGADT7-lam/SV40細胞，用接菌環在融化的菌液表面蘸一下，在SD/-Leu固體平板上劃線，30℃倒置培養2天；
2、從平板上挑取單克隆落接種到液體SD/-Leu中，30℃振蕩培養過夜至OD600達0.8
六、點菌
1、分別配制含有5ug/ml 3-AT的SD/-Leu/-his/-Trp平板和SD/-Leu/-Trp平板。
2、將步驟3~5中擴大培養的菌株，按照五個稀釋梯度，每滴2ul進行酵母點菌實驗，28℃倒置培養7天，進行掃描觀察。
學會了嗎？酵母單雜實驗的詳細操作步驟我們就全部介紹到這里啦，希望能給正在進行實驗設計的你一些參考，如果您有酵母單雜實驗外包的需求可以直接給客服留言，技術會馬上給到回復~我們下期見！
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