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流式檢測細胞實驗方法及檢測結果圖解讀

2021-04-21 14:09:08

來源/作者:普拉特澤生物-醫學整體課題外包

  細胞周期,是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程,分為間期與分裂期兩個階段。細胞間期又分為C0期、G1期、S期、G2期;細胞分裂期即M期。


G0/G1期:G1期,細胞體積逐漸增大,細胞開始RNA和蛋白質的合成,DNA含量保持二倍體狀態,G0期是脫離細胞周期暫時停止分裂的一個階段。但在一定適宜刺激下,又可進入周期,從DNA含量上無法區分G0與G1期;

S期:在這一階段完成DNA的合成以及合成與DNA組裝構成染色質等有關的組蛋白。DNA含量在此時期增加,介于G1期和G2期之間;

G2/M期:G2期是DNA復制結束和開始有絲分裂之間的間隙。從DNA含量上同樣無法區分G2期和M期。


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PI/RNase染色法技術原理

檢測細胞周期最常用的方法就是檢測細胞DNA含量,正常生長的細胞都會經歷分裂過程,G0/G1期是兩倍體時期,S期DNA開始合成,到G2/M期,細胞處于四倍體時期,之后細胞一分為二,進入下一個細胞周期。

碘化丙啶(Propidium ,簡稱PI)是一種雙鏈DNA的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈DNA結合后可以產生熒光,并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比。細胞內的DNA被碘化丙啶染色后,可以用流式細胞儀對細胞進行DNA含量測定,然后根據DNA含量的分布情況,可以進行細胞周期和細胞凋亡分析。


實驗方法以懸浮細胞為例

1、離心收集細胞,棄上清,用預冷的PBS洗滌2次;

2、細胞固定:用殘留的少許PBS混勻沉淀,緩慢加入-20℃預冷的70%乙醇,邊加邊搖勻,避免細胞粘連在一起,置于-20℃冰箱固定4h以上;

3、細胞染色:350g離心5 min,棄上清,用2mL的PBS洗滌2次,按照10^6 cells 加入500μLPBS,含50μg/mLPI100μg/mL的RNaseA,4°C避光孵育15 min-30 min(可將PI直接用PBS配成工作濃度,RNaseA現加進去);

4、上機分析:由于PI具有很強的粘附性,容易使細胞聚團,建議過濾后再上機分析,同時別忘了檢查流式儀器的狀態,一般低速收集2-3萬個細胞即可。

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流式細胞周期檢測結果圖解讀:

1、縱坐標Cell Number:即計數的有效細胞數;

2、橫坐標DNA Content:即DNA含量;

3、常用的流式細胞術分析細胞周期的方法是依據細胞DNA含量(橫坐標)來分析的;

4、G0/G1期:DNA復制還沒開始,也是DNA含量最少的,即流式檢測結果圖的第一個峰;

5、S期:DNA開始復制,到完成復制,是一個一倍DNA到二倍DNA的過程,在流式結果圖中顯示期跨度特別大(第二個不高但很寬的峰);

6、G2期:DNA復制完成至分裂的一段時間,此時細胞內含二倍DNA,在流式結果圖中的第三個峰;

7、M期:細胞分裂過程,此時細胞內也是二倍DNA,用DNA含量的方法是無法與G2期分開。

8、右側數字含義:Dip G1-58.65% at 50.38%,即G1期DNA含量平均值為58.65%;G1期細胞數占總數的50.38%,以此類推。


技術總結

1、PI既能與DNA結合,又能與RNA結合,所以要用RNase消化RNA;

2、進樣速度:進樣速度為低速。若峰形較寬,可能就是進樣速度太快;

3、儀器質控定期做,盡可能排除因機器設置引起的峰形加寬;

4、排除粘連細胞(FL2-A/FL2-W),最大程度的減少粘連細胞帶來的假陽性結果。


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