讓你的lncRNA擺脫miRNA的束縛（上）
2021-09-29 13:42:18
來源/作者：普拉特澤生物-醫學整體課題外包
非編碼RNA近幾年來的熱度雖然有所降低，但瘦死的駱駝依然能發文章。如果沒有一個新穎的靶蛋白砸到腦袋上，非編碼RNA的萬精油套路仍然還是廣大基層科研工作者沖擊高分的首選。對于非編碼RNA家族的成員，各位同學最熟悉的當然是lncRNA和miRNA兩兄弟了。這兩兄弟通過一種叫做ceRNA（competitive endogenous RNA）的聽著挺高端，其實挺簡單的機制，硬是在過去的十來年往江湖里灌了不少的農夫山泉。
然鵝，好景不長，miRNA這不爭氣的娃娃近幾年率先顯了疲態，單獨研究miRNA的文章分值區間一再走低，miRNA漸漸地就變成了一個傍著lncRNA這個老大哥出現的小老弟。雖然以lncRNA/miRNA/靶基因為主軸的套路依然適用于3-5分的區間，甚至在你的lncRNA足夠新穎的情況下依然有能力沖擊更高的分數，但是有夢想的lncRNA也開始逐漸往新的方向拓展。
那么這次就由野菜君通過幾篇典型文獻來給各位同學介紹4種有別于ceRNA機制的lncRNA的研究方向，如果你手頭正好有一個熱乎的lncRNA，又不再想走miRNA的水路，或許能從里面找到一些靈感。
（一）
LncRNA與組蛋白甲基化（histone methylation）
本節關鍵詞：PRC2復合物，EZH2，H3K27三甲基化修飾
本節相關文獻：Long noncoding RNA AFAP1-AS1 predicts a poor prognosis and regulates non–small cell lung cancer cell proliferation by epigenetically repressing p21 expression，Molecular Cancer ，IF：10.6
首先我們來看一種lncRNA在告別miRNA后最常見的路子——組蛋白甲基化。組蛋白甲基化是調控基因表達的重要方式，主要包括H3K27me3，H3K9me3，H3K4me3等等。我們以H3K27me3這種與lncRNA的相關報道最多的修飾方式為例，其含義是組蛋白Histone 3 (H3) 的第27位的賴氨酸 (K) 被三甲基化（me3）修飾，而帶有這種修飾的組蛋白結合到靶基因的啟動子區域，就會抑制靶基因的表達。細胞內主要負責H3K27me3修飾的是PRC2（Polycomb Repressive Complex 2）這個復合物。然后呢，這個復合物主要由EZH2, SUZ12, EED等幾個亞基組成，其中EZH2（Enhancer Of Zeste 2）又是直接具有甲基化轉移酶催化活性的最重要的亞基。近年來，發現PRC2以及EZH2在腫瘤中上調，通過抑制多種抑癌基因的表達，發揮促癌作用。為了方便閱讀，我們可以通過一張模式圖對這個機制先有一個大概的印象。
好了，介紹完背景，我們通過一篇典型文獻來看看針對我們的lncRNA，如何研究它調節組蛋白甲基化的機制。這篇文獻18年發表在molecular cancer上（Long noncoding RNA AFAP1-AS1 predicts a poor prognosis and regulates non–small cell lung cancer cell proliferation by epigenetically repressing p21 expression）。值得一提地是，這個雜志影響因子近幾年的影響因子在5-7的區間徘徊，但是2018年神奇地躥升到了10.6分。關于lncRNA對腫瘤基礎表型的功能驗證就不在此贅述了，我們直接看機制部分結果。
首先，作者通過測序和GO分析，發現在A549細胞中敲除AFAP1-AS1能夠引起300多個基因上調兩倍以上（Fig. 4a）以及這些基因與細胞增殖（Fig. 4b）等過程有關。當然，這一步也不是必須的，我們完全可以通過公共數據庫的挖掘（比如TCGA）找出在某腫瘤中與AFAP1-AS1的表達呈負相關的抑癌基因，或直接像（Fig. 4c）和（Fig. 4d）的結果那樣，選取一些經典的抑癌因子進行qPCR的驗證，同時這些抑癌因子又往往是有報道被EZH2抑制的。總之，這一步就是找出調控AFAP1-AS1引起的差異表達基因。
然后呢，作者先是驗證了AFAP1-AS1在核內和胞漿的表達分布，畢竟我們的H3K27me3修飾是發生在核內（Fig. 5a），再通過RIP的方式驗證了AFAP1-AS1與EZH2以及SUZ12均有結合（Fig. 5b）。
小拓展：對于具體lncRNA與EZH2結合后是通過何種方式發揮作用，這個機制大多數研究都是沒有再深究的。就連發表在PNAS上的lncRNA/EZH2套路文章也僅僅是探明了lncRNA上的一段富G的片段（G-rich motif）參與結合了EZH2，而關于EZH2上結合lncRNA的片段，可能存在于其N端的32–42 helix。有興趣的讀者可以自行參看這兩篇補充文獻深入了解（HERES, a lncRNA that regulates canonical and noncanonical Wnt signaling pathways via interaction with EZH2；Conserved RNA-binding specificity of polycomb repressive complex 2 is achieved by dispersed amino acid patches in EZH2) 。
最后，作者把下游的靶基因鎖定在p21這個經典的抑癌基因，進一步驗證了AFAP1-AS1和EZH2分別對p21表達的調控（Fig. 6a，Fig. 6b），同時，通過CHIP實驗，發現敲除AFAP1-AS1后，EZH2以及H3K27me3在p21啟動子區域的結合降低，最終導致p21的表達抑制被解除（Fig. 6c）。
至此，作者用最低碳的方式，驗證了核內的AFAP1-AS1通過結合EZH2（RIP，RNA pull down實驗），將EZH2募集（recruitment）到靶基因p21的啟動子區域（CHIP實驗），EZH2通過將該區域的H3組蛋白進行H3K27me3修飾，抑制p21的表達（WB, qPCR驗證）。將之前的那個作用模式圖用具體的分子代替就是這樣：
當然我們也可以參考其他一些lncRNA/EZH2/靶基因的文獻，進一步增加我們的實驗豐度，但是核心的（最低碳的）機制基本就是該文獻中展現的這樣。值得注意的是，一般來說，lncRNA并不會改變EZH2的整體表達，只是將EZH2招募到啟動子區域；而對于H3K27me3的整體表達，則存在lncRNA的差異性，有的會上調，有的則并不改變。
關于lncRNA與組蛋白甲基化的技術總結
1. 關鍵的驗證內容是lncRNA與EZH2的結合，以及lncRNA對EZH2, H3K27me3在靶基因啟動子區域的富集的調控。
2. 雖然此文獻中沒有展示，但這里強烈建議還是要加上RNA pull down的結果與RIP結果一道作為lncRNA結合EZH2的進一步的驗證。
3. 一般來說不需要再深入研究lncRNA與EZH2的作用機制。
4. 除了H3K27me3，還存在如H3K4me3，H3K9me3的修飾，如果你手頭的lncRNA已經有了與EZH2的報道，不妨嘗試其他幾種修飾。
（二）
LncRNA與RNA結合蛋白（RNA bind protein， RBP）
本節關鍵詞：mRNA穩定性
本節相關文獻：Long Noncoding RNA MEG3 Induces Cholestatic Liver Injury by Interaction With PTBP1 to Facilitate Shp mRNA Decay，Hepatology，IF：14
接下來我們再看另一種lncRNA通過非ceRNA的機制調控基因表達的方式。RNA結合蛋白（RBP），顧名思義是一類可以與RNA結合的蛋白。RBP可以通過與mRNA結合，調控mRNA的剪切（splicing），穩定性（stability），翻譯起始（translation initiation）等過程，從而在翻譯階段調控基因的表達。我們通過這篇2017年發表于Hepatology（14分）上的文章（Long Noncoding RNA MEG3 Induces Cholestatic Liver Injury by Interaction With PTBP1 to Facilitate Shp mRNA Decay），來了解一下經典的lncRNA+RBP的套路。同樣，我們先看一張機制圖來對這個機制有一個初步的理解。
作者一上來就直奔主題，篩選和驗證能夠與lncRNA MEG3結合的RBP：通過有義鏈（sense）和作為陰性對照的反義鏈（anti-sense）的MEG3探針（Fig. 1A），進行RNA pull down后在SDS-PAGE膠上進行考馬斯亮藍染色（非特異的染蛋白質），通過對比anti-sense和sense鏈的差異條帶（Fig. 1B，箭頭所示），將該部分膠進行質譜分析，發現其中所包含的幾十種蛋白中含有PTBP1（正文未展示，補充材料），接著再通過RNA pull down（Fig. 1C）以及RIP（Fig. 1D）實驗進一步確認了MEG3與PTBP1的結合。
接下來，作者通過預測軟件（RNAmap，starbase 2.0）找到了與PTBP1結合的mRNA SHP（Fig. 2A）。然后在三種細胞中通過RIP驗證了SHP mRNA與PTBP1的結合，并且這種結合會受到MEG3過表達的促進（Fig. 2B）。發現沒有，與ceRNA的競爭結合的機制相反，lncRNA在結合RBP后，并不會導致與靶基因mRNA結合的RBP減少，而是促進RBP與mRNA的結合。進一步地，通過RNA pull down實驗，作者驗證了PTBP1與SHP mRNA的哪一部分結合（CDS，3’UTR）（Fig. 2C）。最后，通過mRNA降解實驗，作者驗證了過表達MEG3和（或）PTBP1能夠促進SHP mRNA的降解（Fig. 2D）。
至此，我們可以跟著下面所示的這篇文獻的思路圖，總結lncRNA/RBP/靶分子的研究套路，先通過RNA pull down/質譜篩選和確認與lncRNA結合的RBP分子，并使用RIP和RNA pull down進行驗證；再通過預測找到與RBP結合下游靶分子mRNA，通過RIP，RNA pull down驗證lncRNA是否影響RBP與mRNA的結合，最后通過mRNA降解實驗驗證lncRNA以及RBP對mRNA的表達的變化的影響。
小拓展1：RBP分子并不像miRNA或是EZH2一樣，僅對下游mRNA或基因產生抑制。在上文分享的例子中，PTBP1是降解靶基因的mRNA的，但是也有文獻報道PTBP1能夠增加某些mRNA的穩定性（Long noncoding RNA ANCR inhibits the differentiation of mesenchymal stem cells toward definitive endoderm by facilitating the association of PTBP1 with ID2），或通過選擇性剪切的方式調控mRNA（PTBP1-Mediated Alternative Splicing Regulates the Inflammatory Secretome and the Pro-tumorigenic Effects of Senescent Cells），這也使得RBP的設計套路更加靈活。
小拓展2：關于lncRNA到底是如何影響RBP與mRNA的結合，與上面的EZH2一樣，一般也少有深入研究，誠如上述這篇14分的hepatology也只是在討論里闡述了幾種可能的機制（見下方截圖），留下一句future studies would be necessary讓人浮想聯翩，想要深入探索的同學不妨朝這方面入手（慎重），想要在自己的討論里吹吹水的同學也可以多作借鑒（推薦）。
關于lncRNA與RBP的技術總結
1. 關鍵的驗證內容是lncRNA與RBP的結合，以及lncRNA對RBP與mRNA結合穩定性的調控
2. 一般來說不需要再深入研究lncRNA與RBP的機制
3. RBP存在功能多樣性，可以正向，負向調控下游mRNA的穩定性
4. 如果沒有做質譜的條件，也可以參考預測軟件的結果找到lncRNA可能結合的RBP
好了，考慮到大家可能已經開始出現看文獻時易發的頭暈，惡心的癥狀，本期先為大家介紹兩種lncRNA在離開miRNA后的機制研究方向：第一種是lncRNA通過調控H3K27me3組蛋白甲基化；第二種是lncRNA通過RBP調控mRNA的穩定性，覺得有點啟發的同學可以在清醒后繼續關注，在下一期中我們會為大家帶來另外兩種不同于ceRNA的機制。
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