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        免疫組化/IHC實驗常見問題及其解決方法下篇由普拉特澤生物總結分享。普拉特澤生物病理實驗平臺在承接大量免疫組化代做實驗后總結出了兩篇我們最常遇到的問題和解決方法，上篇請戳《免疫組化/IHC實驗常見問題及其解決方法上》，溫故知新，隨時復習。

        免疫組化常見問題一：雜信號一非特異性染色

        由于內源性lgG、Fc受體、過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素等存在的原因，同時組織在處理過程中如高溫修復也會使更多的內源性生物素暴露，造成染色組織上會出現非抗原部位的非特異性染色、邊緣效應等雜信號。原因分析如下

        1、全片著色

        （1）是否有效地去除了內源性酶和生物素。應注意的是并不是每一種組織均需要進行此步驟，但對于內源性或生物素豐富的組織，如肝臟、腎臟等，需考慮此原因。

        （2）封閉液的使用，是否選擇使用了正確的封閉血清。電荷吸附所造成的非特異性背景染色的消除方法是以二抗動物的非免疫血清(正常血清)，用PBS稀釋為3%-10%溶液孵育切片，以封閉吸附位點。另外，取材時避開出血、壞死區也十分重要。目前市面上供應的些一抗稀釋液，其分中含有大量的保護性蛋白，已經可以起到封閉液的作用，所以在使用這些稀釋液稀釋的一抗進行免疫組化操作時，一般可不必另外進行封閉操作。

        （3）所選擇的抗體是否符合試驗要求。因抗體不純、標本片中含有與靶抗原相似的抗原決定解等原因造成的非特異性染色可通過使用高純度、高特異性的抗體來解決。

        （4）一抗的使用濃度是否過高。過高常常會出現整張片子著色。

        （5）沖洗是否充分，沖洗液體積及沖洗時間均需達到要求，應嚴格行程作規程

        （6）檢查二抗與標本的內源性組織蛋白是否有交叉反應。

        （7）組織抗原彌散，染色結構不清，主要見于組織切片固定不及時或固定時間過短造成。如果抗原熱修復的程度過于劇烈(過長時間)，有時也會出現抗原彌散的現象。

        （8）脫蠟不完全，粘片劑過多。

        2、免疫組化部分著色

        （1）局部著色：切片撈片時應一步到位，避免產生氣泡，組織局部鼓起。

        （2）陰陽著色：切片未放平，滴加試劑偏向一側。

        常見問題二：脫片

        1、多聚賴氨酸玻片質量的問題，購買切片時要注意品牌質量。

        2、組織切的不好，切片機的問題。例如，比較老舊的機器切的厚或者不均勻，或者實驗操作人員手法不好等。

        3、沒烤好，時間短，溫度不夠之類。

        4、操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛生紙從邊緣上慢慢吸水。

        5、修復的問題：抗原修復的高壓時間過長，或者放進100度的修復液時手法不好，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復比檸檬酸容易脫片，但是要用到EDTA的時候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。

        6、一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用PBS的時候盡量用泡的，不要沖。基本上把這些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。

        7、樣本組織的問題，組織有壞死之類越容易脫。

        好啦，那所有的免疫組化實驗相關問題咱們就講完啦，視頻課程請戳《免疫組化/IHC 理論+實操》，科研本質是探索與推翻，或許我們的總結不夠全面，補充和完善的任務就交給各位看文章的科研人，一起留言分享吧。