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Question：細胞鐵死亡的實驗方法有哪些？（普拉特澤生物提供長期穩定的細胞實驗外包服務）

   答：細胞鐵死亡它依賴于細胞內鐵的累積導致的脂質過氧化，涉及GPX4（谷胱甘肽過氧化物酶4）、鐵蓄積、脂代謝異常及非GPX4依賴性機制。
細胞鐵死亡在形態上表現為線粒體皺縮、膜密度增加、線粒體嵴減少或消失，生化特征上則表現為鐵積累、脂質過氧化、線粒體膜電位降低等。
本文將介紹細胞鐵死亡實驗的基本方法，涵蓋細胞培養、鐵離子檢測、脂質過氧化檢測、線粒體形態及功能檢測等關鍵步驟。

一、實驗準備

?【1】細胞培養?：選擇適當的細胞系進行培養，如腫瘤細胞系。將細胞接種于培養皿中，在37℃、5% CO2的培養箱中培養至適宜密度。

【2】實驗試劑?：準備鐵死亡誘導劑（如Erastin、RSL3）、鐵死亡抑制劑（如Ferrostatin-1）、熒光探針（如FerroOrange、Mito-FerroGreen）、GPX4活性檢測試劑、ROS檢測試劑、脂質過氧化檢測試劑等。

二、鐵離子檢測

鐵離子在細胞鐵死亡中扮演關鍵角色。鐵離子的檢測方法包括：

→普魯士藍染色?：
使用普魯士藍染色劑對細胞進行染色，觀察細胞內鐵離子的分布和含量。

?→熒光探針檢測?：使用亞鐵離子探針（如FerroOrange）或線粒體亞鐵離子探針（如Mito-FerroGreen）對活細胞進行熒光成像，檢測細胞內Fe2+的水平。

→比色法檢測?：
使用Iron Assay Kit-Colorimetric試劑盒，通過比色反應檢測組織裂解液中的鐵離子含量。

三、脂質過氧化檢測

脂質過氧化是細胞鐵死亡的主要特征之一，脂質過氧化的檢測方法包括：

?①特異性熒光探針檢測?：使用特異性熒光探針（如DCHF-DA）對細胞進行半定量分析，檢測ROS和脂質過氧化物的水平。

?②ELISA和TBAR檢測?：使用ELISA和TBAR方法檢測脂質ROS下游副產物（如4-HNE蛋白質加合物和MDA）的含量。

③抑制劑協同分析?：利用特異性抗氧化性鐵死亡抑制劑（如Ferrostatin-1）進行協同分析，觀察抑制劑對脂質過氧化和細胞死亡的影響。

四、線粒體形態及功能檢測

線粒體在細胞鐵死亡期間發生顯著變化。線粒體形態及功能的檢測方法包括：

⒈透射電鏡觀察?：使用透射電鏡觀察線粒體的形態變化，如線粒體萎縮、變小、膜密度增加等。

?⒉線粒體膜電位檢測?：使用JC-1等線粒體膜電位試劑盒檢測線粒體膜電位的變化。

⒊線粒體標記物檢測?：使用線粒體標記物（如MitoScene Green I）檢測線粒體的形態和分布。
                                                                                                                五、細胞活力及細胞死亡檢測

細胞鐵死亡導致細胞活力下降和細胞死亡。細胞活力及細胞死亡的檢測方法包括：

?①MTT或CCK-8檢測?：使用MTT或CCK-8試劑檢測細胞的活力，觀察鐵死亡誘導劑對細胞活力的影響。

②凋亡小體檢測?：使用熒光顯微鏡觀察細胞是否形成凋亡小體，以區分細胞凋亡和鐵死亡。

③細胞形態觀察?：使用顯微鏡觀察細胞的形態變化，如細胞膜破裂、細胞裂解等。

六、實驗結果分析

根據以上檢測結果，綜合分析細胞內鐵離子水平、脂質過氧化程度、線粒體形態及功能變化、細胞活力及細胞死亡情況，判斷細胞是否發生鐵死亡及其程度。

七、結論

細胞鐵死亡實驗方法涉及多個關鍵步驟，包括鐵離子檢測、脂質過氧化檢測、線粒體形態及功能檢測以及細胞活力及細胞死亡檢測等。通過綜合分析這些檢測結果，可以判斷細胞是否發生鐵死亡及其機制。
細胞鐵死亡作為一種新型程序性細胞死亡方式，在疾病研究中的重要作用逐漸被揭示，為疾病治療提供了新的思路和方法。

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