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    支原體污染如同潛藏的 “隱形殺手”，悄無聲息地影響細胞生長狀態、改變細胞功能，甚至導致實驗結果偏差。如何在原代細胞無菌培養過程中有效抵御支原體污染？原代細胞培養介紹由普拉特澤生物細胞檢測平臺總結分享，原代細胞培養介紹由普拉特澤生物分子檢測平臺總結分享，細胞檢測平臺為廣大科研實驗人員提供原代細胞分離和培養外包實驗服務。

接下來，我們將為您拆解原代細胞無菌培養的關鍵步驟。

一、實驗室環境與設備的嚴格把控

①實驗室環境是原代細胞培養的 “第一道防線”。在開始培養工作前，需對整個實驗室空間進行全面清潔與消毒。使用專用的消毒劑擦拭地面、臺面和墻壁，重點清潔易積灰角落，減少潛在污染源。同時，定期開啟紫外線燈照射 30 分鐘以上，對空氣和物體表面進行殺菌。
紫外線雖能有效殺滅細菌和病毒，但對支原體的消殺效果有限，因此需配合其他消毒手段。

②培養設備的清潔與維護同樣關鍵。二氧化碳培養箱是細胞生長的 “溫室”，每周至少進行一次內部清潔，使用 75% 乙醇擦拭箱體內壁、擱板和門把手。為防止支原體滋生，可在培養箱底部的水槽中加入無菌水，并定期更換。
超凈工作臺是操作的核心區域，每次使用前需提前 30 分鐘開啟風機和紫外線燈，運行結束后也需用乙醇擦拭臺面，清除殘留細胞和培養基。

二、實驗耗材的無菌處理

實驗耗材的無菌狀態直接決定培養成敗。玻璃器皿如培養瓶、吸管等，在使用前需經過嚴格的清洗和滅菌。先用洗滌劑浸泡、刷洗，去除表面污垢，再用蒸餾水反復沖洗，最后進行高壓蒸汽滅菌，121℃、20 分鐘的條件可有效殺滅包括支原體在內的各類微生物。
塑料耗材如培養板、移液槍頭，應選擇預滅菌產品，拆封時需在超凈工作臺內操作，避免二次污染。

此外，對于無法進行高溫高壓滅菌的耗材，如濾膜、酶等，可采用過濾除菌的方式。0.22μm 的濾膜能夠有效截留支原體，將溶液通過濾膜過濾后，即可獲得無菌液體，可安全用于細胞培養。

三、原代細胞取材與處理的規范操作

原代細胞取材過程中，防止污染至關重要。在動物實驗取材時，需對實驗動物進行嚴格的體表消毒，可先用碘伏擦拭，再用 75% 乙醇脫碘。取材操作應在無菌環境下迅速完成，減少組織暴露時間。若從人體獲取組織樣本，需確保樣本來源合規，并對樣本進行嚴格的微生物檢測。

獲取的組織需進行適當處理以獲得單細胞懸液。在組織剪碎和消化過程中，使用的剪刀、鑷子等器械要隨時用乙醇灼燒滅菌。消化酶的選擇和作用時間也需精確把控，過度消化會損傷細胞，而消化不充分則影響細胞得率。
消化完成后，通過離心、過濾等步驟去除雜質和未消化的組織塊，獲得純凈的細胞懸液。

四、培養基與血清的質量保障

培養基和血清是細胞生長的 “營養源”，其質量直接關系到細胞的健康。選擇知名品牌的培養基和血清，并在使用前進行支原體檢測。可采用 PCR 檢測試劑盒或支原體檢測培養基，對每一批次的培養基和血清進行抽檢。

為防止支原體污染，可在培養基中添加支原體抑制劑。常用的支原體抑制劑如 M-Plasmocin、BM Cyclin 等，能有效抑制支原體生長，但需注意抑制劑對細胞可能存在的潛在影響，應根據細胞類型選擇合適的抑制劑和使用濃度。
同時，血清的滅活處理也不容忽視，56℃水浴 30 分鐘可滅活血清中的補體，但需注意避免過度加熱導致血清營養成分破壞。

五、操作過程中的無菌意識強化

在整個原代細胞培養操作過程中，操作人員需始終保持強烈的無菌意識。進入實驗室前，應更換無菌工作服、口罩和手套，嚴格執行洗手和消毒程序。在超凈工作臺內操作時，動作要輕緩，避免引起空氣震蕩導致污染。盡量減少不必要的物品放置在工作臺上，保持臺面整潔。

操作過程中，避免試劑瓶口和培養器皿口長時間暴露在空氣中，取用試劑后應及時蓋緊瓶蓋。不同試劑和細胞樣本之間要嚴格區分，防止交叉污染。移液槍頭需做到 “一用一換”，避免將支原體等污染物帶入不同樣本或試劑中。

六、定期檢測與污染防控

即使嚴格執行上述步驟，也不能完全排除支原體污染的可能性。因此，定期對細胞進行支原體檢測是及時發現污染的關鍵。建議每周對培養細胞進行一次支原體檢測，一旦發現污染，應立即對污染細胞進行處理，防止污染擴散。
常用的處理方法包括使用支原體清除試劑處理或直接丟棄污染細胞，并對培養環境和設備進行徹底消毒。

    同時，建立完善的細胞培養記錄體系，詳細記錄細胞來源、培養條件、操作過程和檢測結果等信息，有助于追溯污染源頭，及時調整培養方案，提升無菌培養水平。

通過對原代細胞無菌培養關鍵步驟的嚴格把控，從實驗室環境、實驗耗材、細胞取材處理到操作過程和定期檢測，每一個環節都不容忽視。只有將這些細節落實到位，才能有效拒絕支原體污染，為原代細胞培養創造一個安全、穩定的環境，確保科研實驗的順利開展和結果的準確性。

以上內容從多維度解析了原代細胞無菌培養要點。

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