原位雜交是在分子生物學領域應用極為廣泛的實驗技術之一，是在研究生物體發育過程中的一種極為重要的分子遺傳學的研究方法。其英文名為insitu hybridization,其中in situ為拉丁文，原義是"in its natural position."字面的意思理解就是說在其原來的天然的位置處雜交。那么今天的文章呢，小編就帶大家來詳細了解下原位雜交。

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實驗原理

用已標記的核酸探針與組織切片或細胞中的待測核酸中的互補序列雜交, 從而對組織細胞中的核酸進行定性、定位和相對定量分析。是一種直接、簡便的研究基因定位和表達的方法。

基本原理--堿基互補配對原理

探針的分類

1. cDNA(complementary DNA)——互補于mRNA的DNA分子（長度為數百-數千堿基對）：

  優點：1. 克隆于質粒中，可以無限繁殖，取之不盡；2. 較不易被降解；3. 標記方法可靠易行。

2. RNA是單鏈分子（探針長度50-300堿基對）：

  優點：1.雜交效率比DNA探針高；2.在檢測mRNA時所形成的RNA-mRNA雜交體比DNA-mRNA雜交體穩定。

  缺點：容易受RNA酶的污染而被降解

3. 寡核苷酸， 短鏈探針(長度10-50個核苷酸)：根據靶分子而設計序列在DNA合成儀上合成。

  優點：形成雜交體快速(序列短，雜交時易于穿透)；

  缺點：特異性較低（短鏈和簡單）。

核酸探針標記物

1、放射性標記物--3H、32P、35S、125I等

    特點：敏感性高，但半衰期短，有放射性污染，成本高

2、非放射性標記物--生物素、熒光素、地高辛素、辣根過氧化酶、堿性磷酸酶等

    特點：性能穩定，操作簡便，成本低、耗時短，標記探針可較長時間的保存和使用

3、地高辛標記探針的顯色檢測

    地高辛（Digoxigenin 簡寫Dig-）：類固醇半抗原分子，人及多種動物體內不存在類似的物質，無交叉反應。

    特點：敏感性與放射性核素標記的探針相似，較放射性標記系統安全，方便、省時間，定位準確，雜交背景好。

實驗步驟

器材的特殊處理

DNA-FISH：穩定性較好，一般不需特殊處理。常規的石蠟或冷凍切片均適用于組織或細胞內的DNA原位雜交。

RNA-FISH：RNA酶幾乎無處不在，而且一般的消毒方法不能將其滅活。因此，當檢測RNA或用RNA作為探針時，從標本準備到雜交結束前，都要注意預防 。

去除或抑制RNA酶方法

1. 物理方法：

(1)取材的器具用火焰灼燒過或高溫消毒

(2)標本盡早固定，固定劑可滅活部分RNA酶

(3)所用玻璃器皿均須DEPC水浸泡(37 ℃，2h)，蒸餾水清洗后高壓消毒，然后180℃處理3h以上

(4)塑料器材最好用滅菌的一次性用品或DEPC處理

(5)整個操作過程帶手套和口罩。

2. 化學方法：

(1)焦碳酸二乙酯( DEPC )

(2)RNA酶抑制劑（有毒）

取材

目的：既要充分保留被測核酸，（特別是RNA）不被降解，又要盡可能維持原有組織或細胞的形態結構。

步驟：基本與免疫組織化學技術相似，即組織要求新鮮和迅速投入固定液。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.0-7.6），含有1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時即可，較大的標本固定不要超過2小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40分鐘，一般不要超過1小時。取材過程中避免手指、唾液和未經RNA酶抑制處理的器具接觸標本。冷凍切片以厚5~30um最佳，40℃烤箱內干燥2小時后儲存在-80℃超低溫冰箱，在-20℃可保存２～３周，在-70℃可保存數月之久。

對照實驗設置的意義

目的：保障實驗結果的準確性和特異性

標本對照、探針對照、雜交體對照、檢測系統對照

陰性對照：排除非特異性雜交等因素造成的假陽性；

陽性對照：證明雜交步驟及試劑可靠性；

對照實驗設置愈多，實驗結果的可靠性就愈大。

注意：每次實驗都應有陽性對照和陰性對照。

常用對照組的設置

(1)標本對照：選用已知為陽性或陰性的組織

(2)空白實驗: 無探針的雜交液進行雜交

(3)選用其他生物學方法進行對照實驗：提取標本DNA和RNA進行Southern和Northern印記雜交、qPCR、RT-PCR

(4)RNA酶或DNA酶預先處理標本后雜交反應

(5)選用標記的非特異性（載體）序列或不相關的核酸探針進行雜交。

(6)探針孵育后的檢測系統對照

注意事項

由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的極少數，加上基因僅由四個堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現非特異性染色。通過不加探針和用陰性標本做對照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現象時，用預雜交液對含探針的雜交液進行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應加強探針雜交后的洗滌。如果有少量的細胞核著色屬于正常情況；如果出現大量的細胞核著色，往往和標本固定時間過長有關，應重新處理標本。

實驗結果可能的問題和原因

1.標本形態結構不佳

  a. 取材的標本不新鮮，核酸有不同程度的降解；

  b. 雜交預處理中蛋白酶消化不當所致；

  c. 雜交溫度較高、孵育時間長易造成切片的飄浮或脫片。

2.雜交信號弱

 a. 探針鏈太長不易深入細胞（50－100個堿基最佳）；

 b. 探針的標記不好；

 c. 靶序列暴露程度不佳；

 d. 探針和（或）靶序列的變性條件欠佳。

3.無雜交信號

 a. 標本內無靶序列的存在；

 b. 標本內存在靶序列，因實驗某個環節的失誤導致后者可能降解。

4.非特異性著色

 a. 探針特異性；

 b. 組織細胞內的內源性酶；

 c. 組織細胞內的某些成分與檢測系統的抗體非特異性結合。

原位雜交的應用

①細胞特異性mRNA轉錄的定位，可用于基因圖譜，基因表達和基因組進化的研究；

②感染組織中病毒DNA/RNA的檢測和定位，如EB病毒mRNA、人類乳頭狀瘤病毒和巨細胞病毒DNA的檢測；

③癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉錄水平的表達及其變化的檢測；④基因在染色體上的定位；

⑤檢測染色體的變化，如染色體數量異常和染色體易位等；

⑥分裂間期細胞遺傳學的研究，如遺傳病的產前診斷和某些遺傳病基因攜帶者的確定，某些腫瘤的診斷和生物學劑量測定等。

案例展示

好了，關于原位雜交的介紹就先告一段落了，如有實驗相關需要可點擊下方了解更多哦~