RACE實驗優化策略：提升實驗成功率的實用技巧
2024-12-23 16:43:53
來源/作者：普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺
今天普拉特澤生物跟大家一起學習的是RACE實驗優化策略，RACE實驗優化策略及提升實驗成功率的實用技巧主要包括以下幾個方面：
一、引物設計與選擇
⑴?引物長度與GC含量?：
引物長度建議控制在23-28個核苷酸之間，不超過30個。
GC含量應保持在50%-70%之間，以確保引物的穩定性和擴增效率。
⑵Tm值設定?：
Tm值（熔解溫度）應大于等于65℃，若Tm值超過70℃，建議使用Touchdown PCR策略，以提高產物特異性。
⑶基因特異性引物（GSP）設計?：
針對同一待測轉錄本，可設計多條GSP以提高擴增成功率。
對于較長（>10 kb）或豐度較低的轉錄本，GSP應盡量靠近cDNA末端，以提高擴增效率。
若擴增效果仍然欠佳，可考慮讓NGSP（巢式引物）的5'末端與GSP的3'末端有5-15個核苷酸的重疊，以提高二輪巢式擴增時的特異性。
二、實驗操作細節
Ⅰ.?RNA質量檢測?：
在進行RACE實驗前，必須檢測RNA的完整度。可通過瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA條帶的清晰度和完整性。
使用高質量的RNA提取方法，盡量保證RNA的純度，避免RNA降解或污染。
Ⅱ.反轉錄酶選擇?：
根據實驗需求選擇合適的反轉錄酶。例如，3'端的cDNA可使用MMLV酶，而5'端的cDNA則可能需要更高要求的SMARTScribe酶。
Ⅲ.PCR條件優化?：
根據目標基因和引物的特性，優化PCR條件，如退火溫度、延伸時間等。
若擴增目的片段較長（>3 kb），可適當延長72℃的延伸時間。
Ⅴ.巢式PCR應用?：
若上一輪PCR沒有理想的特異產物，或產物非特異條帶過多，可考慮使用巢式PCR提高克隆的準確度。
巢式引物應在原GSP的基礎上，往前或后移動重疊一定數量（如10bp），形成內外引物進行擴增。
三、實驗后處理與驗證
?⑴產物驗證?：
將目的序列切膠回收，并連接到克隆載體進行測序驗證。
比對測序結果，分析、拼接得到的序列。
?⑵條帶選擇與測序?：
若出現多個條帶，應分別驗證。可根據大小預測選擇可能的目標條帶進行回收測序。
條件允許時，可設計巢式的特異性引物進行二次PCR驗證。
四、其他注意事項
?⒈實驗重復性?：
為確保實驗結果的可靠性，建議進行多次重復實驗。
?⒉實驗記錄與數據分析?：
詳細記錄實驗步驟和結果，便于后續分析和問題排查。
對實驗數據進行準確分析，避免誤導和錯誤結論的產生。
綜上所述，通過優化引物設計、注意實驗操作細節、合理應用巢式PCR以及嚴格進行產物驗證等措施，可以顯著提升RACE實驗的成功率。希望這些實用技巧能對你的實驗有所幫助！
好，今天關于RACE實驗
優化策略
就說到這里
覺得有用歡迎轉發收藏
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
微信關注公眾號
湘公網安備