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【科研專題】自噬研究全解析（二）想研究自噬流？這幾種檢測方法你得知道！

2025-04-28 13:50:16

來源/作者：普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺

    大家好！今天普拉特澤生物繼續跟大家一起學習【科研專題】自噬研究全解析（二）。想研究自噬流？這幾種檢測方法你得知道！

自噬，這一細胞內高度保守的降解過程，就像細胞專屬的 “清潔隊”，能清除受損的蛋白質、細胞器，維持細胞內環境穩態，在發育、免疫和疾病發生發展等多個生理、病理過程中扮演關鍵角色。自噬流，描述的正是自噬發生過程中，自噬體形成、與溶酶體融合，以及底物降解的這一動態流程。檢測自噬流，對理解自噬機制、疾病發生發展及尋找干預靶點至關重要。


檢測自噬流的方法有多種，以下是一些常見的方法：


電鏡觀察自噬體的形成——自噬檢測金標準

自噬體屬于亞細胞結構，需要使用透射電子顯微鏡觀察自噬體的形態。


電鏡檢測自噬主要是基于辨認自噬體結構特征


Western blot 檢測自噬相關蛋白

LC3貫穿整個自噬過程，是目前公認的自噬標記物。利用WB檢測LC3- 11/I比值的變化以評估自噬的強弱。LC3-I/II 的形成和降解是一個動態過程，瞬時LC3-I I表達不能反映自噬程度，需增加自噬的抑制劑、自噬的激動劑，正反證明自噬的發生。


p62作為自噬的重要受體，主要依賴于自噬途徑進行降解。因此，P62的蛋白水平也常常用來指示自噬的降解情況。


LC3 雙熒光標記法：觀測自噬流的神器

mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系讓自噬研究更上一層樓！自噬流的順暢對細胞生理功能至關重要哦！


這個方法是用同時帶有 RFP 和 GFP 的病毒感染細胞。GFP 在酸性環境下會淬滅，而 mRFP 不受影響。當自噬發生時，會看到明亮的黃色熒光，這就是被紅色熒光和綠色熒光同時標記的自噬體啦！當自噬體和溶酶體融合，pH 值降低，GFP 熒光淬滅，就只能看到紅色熒光了呢！所以，GFP 的減弱表示自噬溶酶體形成順利，GFP 越少，自噬小體到自噬溶酶體的流通就越順暢。反之，融合被抑制，自噬溶酶體進程就受阻了哦！而 mRFP 一直穩定表達，通過 GFP 與 mRFP 的熒光比例就能評價自噬。


在研究自噬過程中，構建自噬雙標穩株（如mRFP-GFP-LC3系統）需要配套的質粒、病毒和抗體工具。以下是普拉特澤生物針對自噬雙標研究的全面推薦，涵蓋質粒、病毒和抗體，幫助您高效開展實驗。
常用的病毒工具推薦

（1）慢病毒（Lentivirus）


特點：高效感染多種細胞類型，可穩定整合到基因組中，適合構建穩定細胞系。


推薦病毒：

Lv-LC3B-oe(mCherry,GFP)慢病毒

Lv-LC3-oe(RFP，GFP)慢病毒


以上兩種均可用于構建自噬雙標穩株、監測自噬體形成。


（2）腺病毒（Adenovirus）


特點：高感染效率，適合短期表達實驗。


推薦病毒：

Adv-LC3B-oe(mCherry,GFP)腺病毒

Adv-LC3B-oe(RFP,GFP)腺病毒


（1）A549-mRFP-GFP-LC3B自噬雙標穩株

（2）MCF-7-mCherry-GFP-LC3自噬雙標穩株     

（3）SH-SY5Y-mCherry-GFP-LC3自噬雙標穩株

以下是我們構建自噬雙標穩株的案例分享：

質粒產品推薦


質粒是構建自噬雙標穩株的基礎工具，以下是常用的自噬相關質粒：
（1）mRFP-GFP-LC3質粒
用途：用于實時監測自噬流（autophagic flux）。GFP在酸性環境中淬滅，而mRFP穩定，因此可以區分自噬體（GFP+/mRFP+）和自噬溶酶體（mRFP+）。


推薦

ptfLC3（貨號：BR124）

pCDH-CMV-mRFP-GFP-hLC3B-EF1A-Puro（豐暉貨號：BR641）


（2）LC3相關質粒
用途：LC3是自噬的標志性蛋白，可用于研究自噬體的形成。

推薦：

pEGFP-LC3b（貨號：BR161）

pmCherry-LC3a（貨號：BR156）


（3）自噬相關基因過表達質粒
用途：研究特定基因對自噬的調控作用。

推薦：

pCMV-ATG5（貨號：22952）     

pCMV-Beclin1（貨號：24388）

pCMV-ULK1（貨號：27631）


（4）自噬相關基因敲除質粒
用途：通過CRISPR/Cas9技術敲除自噬相關基因。

推薦：

lentiCRISPR v2（貨號：BR521）

pSpCas9(BB)-2A-GFP（貨號：BR080）


抗體產品推薦
抗體是驗證自噬相關蛋白表達和功能的重要工具。以下是常用的自噬相關抗體：
（1）LC3抗體
用途：檢測LC3-I和LC3-II的轉化，評估自噬活性。

推薦抗體：

LC3B Polyclonal Antibody（貨號：Fab8383）


（2）p62/SQSTM1抗體
用途：檢測自噬底物的降解，評估自噬流。

推薦抗體：

SQSTM1/p62 rabbit pAb（貨號：Fab14039）


（3）ATG5抗體
用途：檢測ATG5蛋白表達，研究自噬體的形成。

推薦抗體：

ATG5 Rabbit Polyclonal Antibody（貨號：Fab1156）


（5）ULK1抗體
用途：檢測ULK1蛋白表達，研究自噬的起始。

推薦抗體：

ULK1 Polyclonal Antibody（貨號：Fab15637）

關于以上相關產品都可以在普拉特澤生物官網：http://www.zjgzfxx.com/

看完這些 “細胞清潔工” 的檢測門道，你是否好奇：

自噬流紊亂究竟如何推動疾病進程？或是哪種方法最適合你的研究？

歡迎在評論區分享你的腦洞或疑問，說不定下一篇深度解析，就為你量身定制！

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