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        原位雜交操作步驟由普拉特澤生物為大家總結分享，我們常見的原位雜交主要是RNA原位雜交與熒光原位雜交。普拉特澤生物病理實驗平臺為給大家詳細分享FISH原位雜交的實驗操作步驟，一起來看看吧！（DNA原位雜交少見，如需要實驗步驟可留言后期分享哦）

        以癌組織為例，實驗原理步驟如下：

        原位雜交的實驗原理我們有提到過：用已標記的核酸探針與組織切片或細胞中的待測核酸中的互補序列雜交, 從而對組織細胞中的核酸進行定性、定位和相對定量分析。基本原理--堿基互補配對原理。

        癌組織原位雜交實驗步驟：

        1. 將準備做原位雜交的樣本常規脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。

        2. 玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。

        3. 石蠟切片經常規脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內源性酶。蒸餾水洗3次。

        4. 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（1 ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻），37℃或室溫消化3--30分鐘（視標本新舊、厚薄自行調整）。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。

        5. 后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6），含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。

        6. 原位雜交的預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體，不洗。

        7. 雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據雜交情況可以調節)。

        8. 雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。

        9. 滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗。

        10.滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

        11.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

        12.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。

        13.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現則可繼續顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。

        14.蘇木素復染，充分水洗。

        15.酒精脫水，二甲苯透明，封片。

        好了，關于FISH實驗的詳細操作步驟我們就講完了，但是大家要注意的是，不同的組織樣本做原位雜交的實驗方案與步驟均會有相應的調整，準備進行實操的同學需要研究學習更多的實驗案例來制定合適的方案以得到最好的實驗結果。當然啦，普拉特澤生物隨時在為您提供原位雜交代做服務哦。更多是原位雜交實驗案例可直接聯系客服桃子姐姐：18570028002 領取觀看哦！