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 熒光原位雜交操作步驟由普拉特澤生物總結分享，上期我們分享了RNA原位雜交的詳細操作步驟，感興趣的同學可以回去復習哦。普拉特澤生物實驗室專業承接熒光原位雜交等組織檢測實驗，經驗豐富，質量可靠，那現在我們就來看看以某組織樣本為例，FISH檢測的實驗原理與詳細步驟吧！

        熒光原位雜交技（FISH）原理：是利用熒光標記的特異核酸探針與細胞內相應的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號，來確定與特異探針雜交后被染色的細胞或細胞器的形態和分布，或者是結合了熒光探針的DNA區域或RNA分子在染色體或其他細胞器中的定位。

熒光原位雜交技（FISH）實驗步驟：

1.切片脫蠟水化。

2.通透
a.【1XPBS】清洗5 min；b.加入預冷的【通透液】（含0.5%TritonX-100的PBS），4°C靜置5 min；c.棄去【通透液】后，加入【1XPBS】清洗5 min，3次。

3.探針檢測

a.加入200 uL【預雜交液】，37°C封閉30 min；（預雜交液：將適量BlockingSolution與Pre-hybridizationBuffer按
照1：99混勻后，37℃孵育至透明澄清狀態（約30 min）后，分裝保存。在使用前，須在37℃氣浴或水浴中孵育至澄清透明。）b.預雜交同時，將【雜交液】在37°C中預熱；c.避光條件下，把2.5uL探針加入到100μl【雜交液】中；注：探針濃度可根據具體實驗情況進行優化。雜交液配制：將適量BlockingSolution與HybridizationBuffer按照1：99混勻，37℃孵育30min后分裝保存。在使用前，須先在37℃氣浴或水浴中孵育30 min。雜交液顏色偏黃屬于正常現象注：PrehybridizationBuffer（試劑A）和HybridizationBuffer（試劑B）從低溫取出時可能有沉淀析出，屬于正常現象。

d.棄去切片中的【預雜交液】，加入100uL含有探針的【探針雜交液】，避光，37°C雜交過夜。e.避光，42°C，【雜交洗液I】清洗3次，每次5 min，以降低背景信號；f.避光，42°C，【雜交洗液II】清洗1次；g.避光，42°C，【雜交洗液III】清洗1次；h.避光，【1XPBS】清洗，室溫5min。注：所有指定溫度的步驟，注意將相關試劑預熱到對應實驗所需溫度后再使用。

4.DNA染色a.避光，【1XDAPI染色液】染色10 min，染色液用量以覆蓋待雜交區域所有細胞為宜；b.避光，【1XPBS】清洗3次，每次5 min。(如組織有自發熒光，可增加步驟蘇丹黑自發熒光淬滅劑進行淬滅。）

5.封片避光條件下，滴加封片劑用蓋玻片密封，進行熒光檢測。

        好啦，那關于熒光原位雜交詳細的操作步驟到這里就結束啦，供大家學習參考。和RNA原位雜交一樣，新手如果準備上手操作的話不建議操作照搬哦，不同的實驗樣本實驗方案或許會有相應的調整，需要技術咨詢的同學歡迎給客服留言，技術會一一詳細解答，更有原位雜交外包需求的同學，普拉特澤隨時為您服務哦！