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Treg細胞流式染色及檢測實例分析

2021-05-20 16:55:21

來源/作者:普拉特澤生物-醫學整體課題外包

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1 Treg細胞流式檢測設門策略


Treg細胞簡介

調節性T細胞(Regulatory cells,簡稱Tregs )是一類控制體內自身免疫反應性的T細胞亞群,早期亦稱做suppressor T cells。調節性T細胞可分為天然產生的自然調節性T細胞(n T-regs)和誘導產生的適應性調節性T細胞(a T-regsi T-regs),如Th3Tr1,另外尚有CD8 TregNKT細胞等,與自身免疫性疾病的發生關系密切,其異常表達可導致自身免疫性疾病。其中Tr1細胞分泌IL-10Th3細胞分泌TGF-β

1995Sakaguchi發現成年鼠中近10%的外周CD4+T細胞表達IL-2受體αCD25。去除這群細胞會引起小鼠自發產生多種自身免疫性疾病而回輸該細胞則阻止疾病的發生。因此將這群細胞命名為CD4+CD25+調節性T細胞Treg

調節性T細胞與自身免疫性疾病(如I型糖尿病、系統性紅斑狼瘡、再生障礙性貧血、多發性硬化、炎癥性腸病、重癥肌無力)有關聯,類風濕性關節炎、自身免疫性甲狀腺炎,自身免疫性肝病、多種腎臟疾病等很多自身免疫性疾病的發病也有關。調節性T細胞對于自身免疫性疾病的發生和發展都具有重要意義,對其進行深入研究將有助于了解自身免疫性疾病的發病機制,對疾病預后判斷、進一步的治療有著深遠的意義。


Treg細胞流式染色實例

Human (Blood): Treg cells

1.標志物:CD4+CD25+Foxp3+ cells

2.流式細胞儀:Beckman CoulterCytoFLEX

3.Panel設置如下


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圖一

備注:由于CD25屬于連續性表達的抗體,盡量在允許的條件下設置FMO對照,FoxP3我們強烈建議使用FMO對照,因為表達量不高,如果不設置FMO,可能會設門不正確的情況。

4.流式抗體及用量:FITC anti-humanCD4(5μL/test357406Biolegend) APC anti-human CD25 (5μL/test 302610 Biolegend) PE anti-human Foxp3(5μL/test320208 Biolegend)

5.淋巴細胞分離:采用人淋巴細胞分離液(7111011,達科為生物)分離人外周血淋巴細胞。首先取3 mL淋巴細胞分離液,平衡到室溫,然后把用3mL PBS稀釋3mL外周血后加到淋巴細胞分離液上層(注意小心操作,切勿把血液加到淋巴細胞分離液下層),500g離心30 min取白膜層細胞,2mL PBS洗滌2~3次后,細胞計數,調整細胞濃度至1×107/mL,后續實驗全部采用100μL /tests/106cells

6.染色條件:首先Human TruStain FcX?(5μL/test;422302;Biolegend),4℃,15 min 接著CD4CD25表面染色,4℃, 30 min然后破膜固定(True-Nuclear? Transcription Factor Buffer Set;424401;Biolegend;一般情況下采用True-Nuclear? Fix Diluent稀釋True-Nuclear? 4× Fix Concentrate為1×Fix solution),室溫避光,60 min后采用ddH2O稀釋10× PermBuffer1×Perm Buffer進行破膜,重復2~3次;

最后采用100μL1×Perm Buffer重懸細胞Foxp3核內染色,4℃30 min

7.     分析軟件:Flowjo (10.0.7)

8.     圈門策略及染色: 見圖2

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不同供應商的Foxp3和破膜劑染色效果比對