Western blot檢測_蛋白質免疫印跡實驗注意事項—新手必看超全
2022-02-28 15:34:03
來源/作者：普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺
Western Blot（蛋白質免疫印跡）實驗操作注意事項由普拉特澤生物旗下生物科研培訓品牌《春風學院》總結分享，根據成百上千例Western Blot檢測經驗匯總，從蛋白樣本制備、凝膠配制、電泳、轉膜、封閉、抗體雜交等方面詳細講解WB檢測過程中常見容易忽略的操作錯誤與注意事項，新手必看。普拉特澤更提供線下WB檢測培訓及分子生物學實驗各項外包服務。
WB實驗作為分子生物學中最為常見的實驗，卻蘊含了很多技巧與知識，看到別人WB檢測結果那么漂亮，你連蛋白樣本都制不出來是不是特別的羨慕嫉妒恨呢。不用擔心，普拉特澤在和WB斗志斗勇的過程中積累了不少實驗操作經驗，為大家提供線上WB操作視頻培訓，線下實操一對一帶教，是您提升實驗操作技能的好老師哦。老話說，前人種樹、后人乘涼，現在我們就來看看，WB實驗過程中有哪些需要我們關注的操作注意事項吧！
一、WB檢測——蛋白樣本制備注意事項
1、蛋白質的樣品制備是Western Blot的第一步，根據普拉特澤上萬例蛋白質免疫印跡檢測經驗，WB待測組織凈重與裂解液的體積比例為1g:10ML。同時，要想獲得所有蛋白質，還應注意以下問題：
（1）在合適的條件下，保持蛋白質的最大溶解性和可重復性。
（2）選擇合適的表面活性劑和還原劑，使其形成各自多肽的溶液。
（3）盡量去除核酸、多糖、脂類等分子的干擾，裂解完畢離心之后取中層澄清溶液時避免吸到底層沉淀和上層脂類。
（4）整個制作蛋白樣本的制備過程必須在低溫下進行，避免細胞破碎釋放出各種酶類，但是注意不要反復凍融哦。
二、WB檢測——凝膠的配制注意事項
制膠關鍵是聚合時間，分離膠聚合控制在從加入10%AP和TEMED至開始凝膠，時間為10—20分鐘(未完全凝聚)，濃縮膠最佳聚合時間為8-10 min，可通過控制AP和TEMED量來控制。具體的實驗操作方法與凝膠配方可以觀看春風學院《western blot 理論+實操》參觀學習哦。
三、WB檢測——電泳注意事項
（1）應待凝膠充分凝固后電泳，或者催化劑加入后充分混勻，否則條帶容易中間凹陷兩邊翹起。
（2）兩板玻璃之間排除所有的氣泡，防止條帶中間鼓兩邊下陷。
（3）加樣前離心，選擇適當的樣本緩沖液，加適量的樣品促溶劑，防止wb條帶拖尾或蛋白出現紋理。
四、WB檢測——轉膜注意事項
（1）要使Western Blot蛋白質組分能有效的從凝膠轉移到固相紙膜上，緩沖液的PH值很重要。分子量不是很大的蛋白質區帶要適當改變轉移緩沖液的pH，而分子量較小的蛋白質，可以在緩沖液中加入適量甲醇促進它們固定在固相膜上（大分子量的蛋白質不適合加甲醇）。
（2）電轉印膜常用的NC膜使用的最為普諞，它的蛋白質容量大，可用各種染色方法進行檢測，但是它與蛋白質的結合是非價性的，膜干燥后很脆。操作過程中要注意。
五、WB檢測——封閉注意事項
（1）蛋白質免疫印跡電泳轉膜過后，為防止與一抗或二抗非特異性結合，膜上其他沒有結合蛋白質的空白位詈需要用封閉液加以封閉。
（2）封閉液中加入適量的防腐劑，避免封閉蛋白變性影響封閉效果。
六、Western Blot——抗體雜交注意事項
（1）適當降低抗體的濃度，增加洗膜次數防止非特異性條帶過多。
（2）優化轉移時間和電流，增加抗體的濃度，適當延長曝光時間，防止信號弱、可能轉膜不完全。
Western Blot實驗操作每一步的注意事項小編就總結到這里啦，是不是對新手友好很全面避雷呢？想學習完整的WB（蛋白質免疫印跡）實驗步驟的小伙伴可點此跳轉學習哦：Western blot最全實驗操作步驟。
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