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本文由普拉特澤生物旗下生物科研培訓品牌《春風學院》分享，春風學院提供線上視頻課程培訓，線下實操一對一帶教，是你快速掌實驗技能的好幫手哦，關于Western blot檢測詳細的實驗步驟及實驗干貨輸送，篇尾有視頻教程方便大家理解

   Western blot檢測實驗是科研造假的重災區，WB檢測其操作上手難度也名列前茅，就連大部分實驗老手也飽受折磨，所以想要獲得一張漂亮的WB結果非常不容易。

 相信每個做WB（蛋白質免疫印跡）實驗的高手都有一些自己的獨門經驗，而普拉特澤生物做為依托互聯網從事線上實驗服務外包服務，并面向全國承接實驗外包的生物科研公司，分子生物學實驗中的WB檢測也承接了數以千記的的WB實驗項目，積累了大量的WB檢測案例，為廣告科研工作者提供實驗步驟的教學與培訓服務。

   好了廢話不多說上正菜!WB檢測實驗步驟:
   WB檢測第一步：準備蛋白樣本
   （1）首先在顯微鏡下觀察確保收集健康的、按預期生長的wb檢測的細胞樣本。

 
  WB檢測第二步：SDS-PAGE凝膠電泳   

   (1) 清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手用無塵布輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后晾干。未徹底清潔干凈容易導致蛋白質印跡跑膠痕跡不清晰，wb實驗結果分析造成困擾。

   (2) 組裝制膠器：玻璃板對齊后放入夾中卡緊，加滿純水或蒸餾水進行試漏，5 min左右液面不下降即可。

   (3) 配制分離膠：根據目標蛋白的分子量來確定分離膠的濃度。目標蛋白的分子量越小，丙烯酰胺/bis 的百分比越高。目標蛋白的分子量越大，丙烯酰胺/bis 的百分比越低。按配5%分離膠為例，按下表比例配制好膠液，動作盡量迅速。特別注意，TEMED起凝膠作用，所以待一切都準備就續再最后加入TEMED，混勻后立即灌膠。灌膠時，可用10 mL移液器吸取，沿內側玻璃壁緩慢放出，1.5 mm厚的玻璃板灌膠約6-7mL左右。最后在分離膠上加1 mL 75%酒精。

western blot實驗 分離膠的配方

   （4） 配制濃縮膠：同樣以配制5％的濃縮膠為例。待分離膠凝固，倒出封液的酒精。按配方配制分離膠，同樣注意最后加入TEMED，而后混勻（不要劇烈搖晃，避免產生氣泡）即可灌膠。將板中剩余空間灌滿濃縮膠后將梳子插入濃縮膠中。插梳子時從一側傾斜插入，最后使梳子保持水平（避免梳子底下有氣泡）。灌膠時也要沿玻璃板緩慢流下以免膠中有氣泡產生。

western blot實驗 5%濃縮膠的配方

   （5） 上樣：加足夠的電泳緩沖液后開始準備上樣(電泳緩沖液至少要漫過內側的小玻璃板)。然后平穩拔出梳子，速度不宜過快，避免加樣孔變形。盡量保證每個加樣孔的形狀一致（可用鑷子將膠撥正）。用10μl移液槍吸取7-10μl樣品緩慢加入加樣孔中（每孔樣品量保持一致，避免條帶長短不一），根據實驗需要在未加樣的任意孔加3μl蛋白marker或同體積的1×Loading buffer。

   （6） 電泳：電泳時電壓為80V，當marker進入分離膠（可看到不同顏色的marker條帶時），可將電壓調整至120V，電泳至溴酚藍跑至膠底即可終止電泳，進行轉膜。
 

    WB檢測第三步轉膜：

   （1）轉膜需準備適量濾紙和1張與膠同等大小的PVDF膜。PVDF膜大小需要根據膠的大小來裁剪，在裁剪時注意不要用收直接接觸PVDF膜。切好的PVDF膜還需于甲醇中浸泡10s，再于轉膜緩沖液中浸泡5min后使用；

   （2）在倒有轉膜液的搪瓷盤里放入轉膜用的夾子，夾子每邊各墊一層海綿墊及適量濾紙（轉膜液的量宜沒過夾子）。

   （3）用切膠尺撬開玻璃板，撬的時候動作要輕。切去非目的蛋白部分，小心剝下分離膠放置在夾子黑色面，用手或切膠板調整使其與濾紙對齊，輕壓搟去氣泡。將適宜大小的膜覆蓋在膠上搟去氣泡。在膜上蓋濾紙并除去氣泡。將夾子另一面蓋上并夾緊，放入轉膜槽，夾子黑色面對槽的黑面，夾子白色面對槽的紅面。整個操作在轉膜緩沖液中進行，操作時盡量避免膠與膜之間有氣泡（轉膜液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通）。
    

WB檢測第四步 免疫反應：

   （1）封閉：將膜移至含有5%脫脂牛奶粉（1×PBST溶解奶粉）封閉液的孵育盒中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h左右

   （2）一抗孵育：將一抗用5%BSA稀釋至適當濃度（根據抗體說明書調整抗體稀釋比）。從封閉液中取出膜，用PBST或水洗去殘留封閉液。將膜放入新的孵育盒，加入稀釋后的一抗，置于4℃冰箱孵育過夜或室溫搖床孵育1h以上，孵育結束后，用PBST洗膜。

   （3）將二抗用PBST稀釋至適當濃度（根據抗體說明書調整抗體稀釋比），室溫下孵育1h后（或者37℃恒溫箱孵育10-15min），用PBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5-10min。
     

WB檢測第五步化學發光：  

   （1）根據wb檢測試劑盒說明書，配制顯影液。
   （2）將孵育完成的膜用鑷子將其平鋪在平板上，移液槍吸取發光底物，均勻覆蓋膜。  

   （3）將平板放入顯影儀。

   最后就是進行整個western blot（蛋白質免疫印跡）實驗結果的拍照與總結分析啦，回顧整個實驗過程，詳細步驟其實就是：提取細胞蛋白、BCA定量、制備蛋白膠、蛋白樣本變性、電泳、轉膜、一抗、二抗、顯影、結果分析。
   是不是很簡單呢？wb檢測的詳細實驗步驟如果您還有實驗過程中的疑問可以關注咱們的春風學院——western blot（理論+實操）篇，或報名進行線下一對一wb檢測培訓，分WB檢測理論分析和WB實驗操作演示，進行系統性的學習實際操作與結果分析哦。

   當然，如果您有western blot（蛋白質免疫印跡）外包的需歡迎選擇我們普拉特澤哦，提供原始數據，死磕真實實驗，全國范圍均可承接，是您的不二選擇。