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【國自然熱點文獻分享】表觀遺傳乙酰化

2021-10-13 14:59:17

來源/作者：普拉特澤生物-醫學整體課題外包

今天，我們跟著今天這篇SCI的思路一起來學習學習吧。

文獻題目是：Histone-deacetylase 8 drives the immune response and the growth of glioma. 影響因子7.451分，今年7月份熱乎乎的發表在Gliae雜志上。主要研究組蛋白去乙酰化酶8（HDAC8）驅動免疫反應，促進神經膠質瘤的生長。

一、抑制HDAC8降低膠質瘤的生長，延長小鼠的存活期

首先，作者在不同的人正常星形膠質細胞系、膠質瘤細胞系、原代膠質瘤細胞、人類神經元來源于誘導的多能干細胞、從癲癇患者樣本中分離的小膠質細胞及小鼠膠質瘤細胞中均檢測到了HDAC8的表達（Figure 1A）。但是，從患者中獲得的原代細胞GBM19和GBM41R中HDAC8表達最高。

接下來，為了研究HDAC8的敲低對膠質瘤發展的影響，作者用HDAC8抑制劑PCI-34051來處理攜帶膠質瘤的小鼠。發現HDAC8的阻斷以濃度依賴的方式減少了膠質瘤的生長（Figure 1B），延長了小鼠的存活時間（Figure 1C），降低了膠質瘤細胞在體內的增殖率（Figure 1D）。

再來看看細胞實驗的結果。PCI-34051降低了大部分細胞的增殖能力（Figure 1E）。但，如果在PCI-34051干預細胞的過程中同時用非活性中間體3（iPCI-34051）處理，細胞的增殖能力不受影響（Figure 1F）。用siRNA敲低HDAC8后（Figure 1G），細胞增殖能力也顯著降低（Figure 1H）。

二、HDAC8調節α-tubulin蛋白乙酰化驅動膠質瘤細胞遷移和侵襲

為研究HDAC8的抑制是否能減少膠質瘤細胞遷移從而影響腫瘤生長。作者用不同濃度HDAC8抑制劑PCI-34051下處理人和小鼠的膠質瘤細胞，發現PCI-34051降低了U87MG和GBM157細胞中Veh的表達，同時降低了五株膠質瘤細胞中EGF和CXCL12的表達，即降低了細胞的遷移能力（Figure 2A）。但是，iPCI-34051對腫瘤細胞CT2A無影響效果（Figure 2B），而HDAC8 siRNA的處理降低了CT2A中EGF的表達（Figure 2B）。此外，體內實驗發現，PCI-34051的干預降低了腫瘤細胞的侵襲性（Figure 2C）。WesternBlot和免疫熒光實驗證實，PCI-34051或HDAC8 siRNA能增加α-tubulin的乙酰化水平（Figure 2D-E）。這些數據表明，抑制HDAC8可減少膠質瘤細胞的遷移和侵襲，并增加α-tubulin的乙酰化。

三、HDAC8調控不同激活狀態下小膠質細胞的遷移和形態的動態變化

考慮到神經膠質瘤相關的小膠質細胞/巨噬細胞（GAMs）招募到膠質瘤團是支持腫瘤生長的關鍵機制，作者接下來探討HDAC8的抑制是否影響GAMs的遷移。首先，分離原代小鼠膠質細胞。用PCI-34051干預后發現HDAC8的抑制完全消除了小膠質細胞的趨化性（Figure 3A）。同時，在用PCI-34051處理的小鼠后發現Iba1+細胞（小膠質細胞/巨噬細胞的標志物）浸潤腫瘤腫的數量減少（Figure 3B）。

為了評估骨髓細胞數量的減少是否是由于小膠質細胞的減少導致的，接下來，作者對小膠質細胞特異性標記物TMEM119進行了免疫染色（Figure 3C）。數據顯示，抑制HDAC8后，TMEM119+細胞在腫瘤區域減少。

接來下，作者又研究了HDAC8對GAMs表型調節的作用。HDAC8的表達在LPS和IFN-γ刺激下特異性降低（Figure 3D）。阻斷HDAC8影響IL-4處理的小膠質細胞的形態學變化（Figure 3E）。

為了進一步研究HDAC8在體內塑造GAMs表型中的作用，從膠質瘤細胞移植后7天開始，用PCI-34051治療17天。處死小鼠，從同側或對側大腦半球分離CD11b+細胞。RT-PCR分析發現腫瘤細胞注射增加了腦膠質瘤半球CD11b+細胞中抗炎基因的表達，并證明PCI-34051治療完全消除了這種效應，同時增加了促炎基因的表達（Figure 4A）。

體外細胞實驗發現，LPS+IFN-γ處理增加了促炎基因的表達，而IL-4增加了抗炎基因的表達（Figure 4B）。用PCI-34051孵育48h，抗炎基因CD163和MMP12的表達降低，促炎基因Nos2和CXCL10的表達增強（Figure 4C）。

綜上，HDAC8驅動小鼠和人GAMs向抗炎表型發展。

四、抑制HDAC8可增加膠質瘤細胞中的NKG2D配體，從而增強NK細胞的細胞毒性

作者假設觸發NK細胞毒性的NKG2D受體配體的轉錄受到HDAC8活性的影響。PCI-34051處理CT2A細胞后，CHIP實驗發現，ulbp1、h60和raea1基因轉錄啟動子激活標志物三甲基化的組蛋白H3賴氨酸4（H3K4me3）的表達水平顯著升高（Figure 5A）。在補充材料中，也可以發現這些基因的轉錄水平顯著增加。

接下來作者進行了NK細胞介導的細胞毒性試驗。NK細胞與PCI-34051處理或未處理的CT2A細胞共培養48h，CD107a+的百分比在PCI-34051處理的細胞中顯著增加（Figure 5B）。

為了進一步研究依賴于HDAC8的NK細胞毒性活性的分子機制，作者分析了穿孔蛋白PRF1。首先從PRF1敲除的小鼠中分離的NK細胞，與PCI-34051干預或未干預的CT2A細胞共培養。PRF1的缺失消除了HDAC8抑制誘導的NK細胞介導的腫瘤死亡（Figure 5C）。用PCI-34051處理攜帶膠質瘤的小鼠也得到了類似的結果，活化的CD69+和NKG2D+NK細胞浸潤腫瘤腫塊的增加，IFN-γ水平無變化（Figure 5D）。