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因為這周看文獻恰好瞄到一篇今年6月發表在oncogene上的研究，主題是關于lncRNA調控大名鼎鼎的m6A修飾。鑒于m6A的名聲在外，我覺得非常有必要寫這篇文獻的解讀作為lncRNA擺脫miRNA專題的補充。那么，開始學習吧~

說起m6A（N6-methyladenosine）修飾，確實是最近幾年國自然的香餑餑。2018年國自然批準的項目中，m6A相關的研究多達65項，相比2017年翻了3倍；而到了2019年，m6A項目達到179項，比2108年又翻了一倍多。其實，早在1974年，m6A就被研究者檢測到(Desrosiers et al. 1974, Perry & Kelley 1974)，但由于缺乏檢測mRNA中m6A位點的方法，研究人員無法識別包含m6A的單個RNA，研究者對m6A作為mRNA調控模式的興趣很快消退。MeRIP-Seq最近技術的進步使得對m6A殘基的全轉錄組鑒定成為可能，這使得這一生物學標記成為新的研究熱點。

我們先來簡單了解一下m6A修飾的過程。m6A修飾指的是RNA上的腺苷酸（A）的第六位N發生甲基化。參與m6A的蛋白可以分為writers，erasers和readers三類，其中writers往核苷酸上添加上甲基，erasers去掉核苷酸上的甲基，readers則是能夠識別帶有甲基修飾的核酸序列。通過下面這張圖我們可以更好地了解這三者是怎么行使功能的。

可以看到，m6A writer 復合物 (RBM15/15B-WTAP-METTL3-METTL14)和m6A eraser (ALKBH5)主要定位在細胞核內。因此，m6A對mRNA的任何動態調控都會在mRNA輸出之前發生在細胞核中。在細胞核中的m6A“印記”本質上是不可改變的，并決定了mRNA在細胞質中的命運。在細胞核中，m6A可以被m6A reader識別（YTH蛋白DC1）。在細胞質中，m6A可以被YTH蛋白DF1、DF2和DF3的識別。

 好了，了解了m6A的基本情況，我們來看看這篇文獻是怎么讓lncRNA在中間插一jio的。（LN4C92                   promoting METTL14-mediated m6A methylation in breast

    cancer cell proliferation and progression，oncogene，IF：7.9，漲分了）

我們先通過機制圖來了解一下全文的大概思路。在乳腺癌細胞中，一條思路（支線）是，LNC942上調writer復合物組成蛋白之一的METTL14的 mRNA穩定性，使得METTL14蛋白表達升高。另一條思路（主線）是，LNC942與METTL14蛋白特異結合(+176 - +265)，增加METTL14的甲基化酶活性，上調下游靶點CXCR4、CYP1B1 m6A甲基化水平，進而增強CXCR4、CYP1B1的mRNA穩定性和表達。

接下來我們看看具體的結果。作者先是在正常乳腺細胞系（MCF10A）和乳腺癌細胞系（MCF7）中進行測序得到差異表達基因，找到了LNC942這個高表達的lncRNA（fig1a），同時在多種乳腺癌細胞系中進一步驗證了LNC942的高表達（fig1b）。然后，通過starbase這個綜合性的預測網站，作者發現LNC942可能能夠與許多m6A相關的蛋白結合。所以在fig1c中，作者通過m6A dot blot assay驗證了m6A在各乳腺癌中的水平，發現在MCF7和SKBR3細胞中表達最高。然后，通過shRNA構建LNC942敲低的細胞系（fig1d）。

接上圖，作者發現敲降LNC942后，能夠顯著降低METTL14這個m6A writer復合物中的組成之一的表達（fig1e）。在組織水平，通過ISH, IHC, qPCR，驗證了LNC942，m6A，METTL14的表達在乳腺癌中升高（fig1f，fig1g）。最后，使用相關性分析，驗證了LNC942與m6A以及METTL14之間存在正相關（fig1h）。注意：在臨床水平中驗證你的關鍵分子A和B是否存在相關性是非常重要的證據。如果沒有數目可觀的臨床樣本，可以借助TCGA數據庫來進行分析。

接下來作者從兩條線驗證了LNC942對m6A的調控，其中一條是直接調控METTL14的mRNA的穩定性。關于作者通過qPCR以及WB驗證沉默LNC942能夠抑制METTL14的mRNA和蛋白水平的結果由于篇幅的關系就不展示了，我們還是來看核心機制的驗證。在fig2f中，通過加入轉錄抑制劑處理細胞，發現細胞內殘留的METTL14隨時間減少（降解），而沉默LNC942能夠加速mRNA降解的速度。另外，m6A dot blot assay實驗驗證了LNC942沉默能夠降低細胞整體的m6A水平（fig2g）。其實我們可以看到，作者只是比較基礎地驗證了LNC942能夠維持METTL14的穩定性，但是對于中間的具體的機制是怎么樣的，可能由于只是一條旁支的非核心機制路線，并沒有作深入的探討。結合我們之前推送的lncRNA與RBP來看，LNC942很可能也是通過結合某種RBP來調控RBP對于mRNA的穩定性的影響。

（相關閱讀：讓你的lncRNA擺脫miRNA的束縛（上））

我們接下來看作者怎么驗證本文的核心機制，也就是LNC942影響METTL14的甲基化酶活性，作者先是通過ISH和IF驗證了LNC942與METTL14的共定位（fig4g），并通過RNA pull down驗證了LNC942與METTL14的結合（fig4h），這也是研究lncRNA與蛋白相互作用的基本方法。

接下來是尋找下游受m6A修飾調控的靶基因，且這些靶基因要與腫瘤以及LNC942相關。通過KEGG分析列出十種可能與LNC942表達相關的細胞功能，其中兩種與腫瘤的發生有關（fig5a）。通過對這兩種細胞功能相關的候選基因進行m6A位點預測，發現CXCR4和CYP1B1具有高可信度的m6A修飾位點（fig5b）。接下來，作者通過測序結果，和qPCR驗證了CXCR4以及CYP1B1在乳腺癌細胞系中表達升高（fig5c，fig5d）。又通過WB和qPCR驗證了沉默LNC942會降低CXCR4以及CYP1B1的表達（fig5e，fig5f）。最后，由于m6A修飾會提高mRNA的穩定性，作者通過mRNA降解實驗發現沉默LNC942會加速CXCR4和CYP1B1的mRNA降解（fig1g）。

到這里，作者得到了結論，CXCR4和CYP1B1可能是LNC942介導的METTL14調控的m6A修飾的新的候選直接靶點。但是，是不是感覺少了點什么呢，感覺少了點什么就對了？這里作者缺少了對于CXCR4和CYP1B1的mRNA的m6A甲基化水平的檢測。此檢測使用的方法是m6A RNA免疫沉淀（m6A RIP），與一般RIP的操作相同，使用m6A的抗體得到RNA后，進行qPCR檢測。

雖然這個實驗還是挺關鍵的，但是覺得這也不影響這是一篇畢竟經典的關于lncRNA調控m6A的范文。在后續的結果里，作者也通過回復實驗，驗證了過表達METTL14能夠逆轉沉默LNC942對CXCR4, CYP1B1，m6A水平，以及腫瘤表型的影響，證實LNC942確實通過METTL14發揮作用。我們可以跟著思路圖復習一遍本文的套路。