CHIP實操常見問題與解決方法總結大全
2022-04-13 17:27:43
來源/作者：普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺
CHIP染色質免疫共沉淀實驗操作常見問題原因及由普拉特澤生物旗下生物科研培訓品牌《春風學院》總結分享，我們提供線上下CHIP檢測實操視頻培訓和線下CHIP實驗外包服務，擁有自己的實驗室與優秀的技術團隊，真實值得信賴。
下面我們就來看看，CHIP實驗操作過程中，有哪些容易出現的問題，一起來看看怎么解決吧。
問題一：非特異性 抗體對照背景高
解決方法：非特異性結合 Protein A 或G beads，將標本和beads混合孵育1h后去除，然后再加入抗體進行反應（包括預純化標本步驟）
問題二：ChIP 緩沖液污染了
解決方法： 重新配制新的緩沖液
問題三：有些Protein A or G beads 產生高背景
解決方法：盡量使用在非特異性對照中背景很低的Protein A/G beads
問題四：CHIP結果背景高、電泳結果難以分辨大小
解決方法：原因可能是DNA片段太大， 對不同類型的細胞，DNA 片段化過程要進行優化。破碎后的DNA片段不應該大于1.5 kbp. 如果使用酶消化染色質的話，應該可以看到單個核小體的存在 (175 bp)
問題五：信號弱
解決方法：原因可能是染色質的片段太小了， 染色質超生破碎的大小不能小于500bp。太小的片段會使的核小體被誤認為核小體間的DNA而被消化掉。如果做N-ChIP，酶切反應足夠來片段化染色質了
問題六：染色質用量不足
解決方法：推薦每次實驗染色質的用量是25 μg
問題七：CHIP免疫沉淀用抗體量不足
解決方法：推薦使用3-5 μg抗體進行初次實驗，如果沒有信號則可以增加到10 μg的用量
問題八：特異性的抗體結合被清除了
解決方法：洗液中的NaCl 濃度不能高于500 mM ，因為這個濃度過強，有可能會消除特異性的抗體結合
問題九：ChIP檢測的細胞沒有被完全裂解
解決方法：推薦使用RIPA buffer裂解細胞
問題十：PCR擴增出現問題
解決方法：如果所有標本包括模板對照 PCR結果信號均過高，那么應該是Real-time PCR溶液污染了，換用新鮮配制的新溶液重新進行PCR
問題十一：標本PCR結果陰性
解決方法：使用 standard/input DNA確認引物是否正確
好啦，關于ChIP實驗操作時的常見問題以及解決方法我們就介紹到這里啦，還有更多要補充的歡迎留言哦！
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