譯：circRNAome分析顯示，circFgfr2通過一個反饋回路調節肌肉生成和肌肉再生

Journal of Cachexia Sarcopenia and Muscle

10.1002/jcsm.12859

名詞解釋

成纖維細胞生長因子受體2(FGFR 2)：具有抑制成肌細胞增殖、促進分化和骨骼肌再生的作用。

絲裂原活化蛋白激酶20(Map3k20)：是MAPK級聯反應的主要成分,可調節許多生物過程,如生長,發育和各種環境脅迫。Map3k20是調控JNK/MAPK信號通路的上游因子之一；

JNK/MAPK信號通路：JNK又被稱為應激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase, SAPK），是哺乳類細胞中MAPK（Mitogen-activated Protein Kinase，絲裂原活化蛋白激酶）信號通路的另一亞類。MAPK-JNK通路可由各種不同環境應激、炎癥細胞因子、生長因子以及CPCR激動劑激活。應激反應信號經RHO家族的小分子GTP酶傳遞到這個級聯。JNK轉運入胞核后可調節多種轉錄因子的活性，進而介導JUN，ELK1，P53等的轉錄活化，它們在細胞周期、生殖、凋亡和細胞應激等多種生理和病理過程中起重要作用。

本文結論

在結論上，作者發現了：

CircFgfr2的功能和機理分析揭示了一種由環狀RNA介導的調節肌發生和肌肉再生的自調控反饋環，為進一步了解其調控機制提供了新的思路。

在機制上，作者發現了：

FGFR 2基因產生了一種保守的環狀RNA——CircFgfr2，它是miR-133的海綿，調節絲裂原活化蛋白激酶20(Map3k20)基因和JNK/MAPK通路。重要的是，轉錄因子Kruppel樣因子4(Klf 4)是JNK/MAPK通路的下游靶點，通過miR-133/Map3k20/JNK/Klf 4自調控反饋環直接結合到CircFgfr2啟動子上，影響轉錄因子Kruppel樣因子4(Klf 4)的表達。RNA結合蛋白G3BP應激顆粒組裝因子1(G3BP1)抑制CircFgfr2的生物發生。

在研究意義上，作者認為：

作者提出了一種由circFgfr2介導的肌生成調控模型，該模型由Klf 4調控，作為miR-133的誘餌，以減輕其對Map3k20的抑制作用，激活JNK/MAPK信號通路。JNK信號的激活抑制Klf 4的轉錄和轉活化活性，最終在肌發生和肌肉再生過程中形成一個自我調節的反饋環。該研究不僅為闡明豬產肉性狀形成遺傳基礎提供新理論，為分子育種提供新的候選基因，也對人類肌肉相關疾病研究具有重要價值。

研究方法

采用鏈特異性RNA序列分析(RNA-seq)和微陣列數據對骨骼肌發育和肌源性分化過程中的動態環狀RNA情況進行了分析。利用生物信息學分析方法對環狀RNA體進行了表征，并確定了與肌細胞發生相關的候選基因。用大體積法和單細胞RNA-seq法鑒定了CircFgfr2的下游基因和途徑。

采用離體或體內Rt-qPCR，Western blotting，雙熒光素酶活性測定，RIP-qPCR，原位雜交，染色質免疫沉淀等，以原代成肌細胞、C2C12細胞和動物模型為基礎，探討了circFgfr2在肌發生和肌肉再生中的作用和機制。

過一下這篇文章的結果

1、27個發育階段骨骼肌環狀RNA分析

（一句話，作者先從茫茫人海中尋找那個對的circRNA。）同時還有作者想表明這個研究也可以延伸到人~，可惜沒辦法直接研究人呀）

為了描述骨骼肌的環狀RNA圖譜，作者分析了一個廣泛的RNA序列(RNA-seq)數據集(GSE 157044)，該數據集涵蓋了骨骼肌的27個發育階段，總共注釋了104896個環狀RNA，其中至少包含2個獨特的背剪接讀碼。在至少五個不同的樣本中檢測到CircRNAs是穩健表達的，因此總共有52918個用于下游分析的高置信度環狀RNA。為了驗證這些RNA的可靠性，選擇了45份，采用不同引物的逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)對其進行了鑒定。45例患者中有43例(95.56%)檢測到BSJ，Sanger測序證實為BSJ。Rnase R處理的總RNA的RT-PCR結果表明，這些rnase R處理的RNA具有抗消化能力，驗證了環狀RNA的循環性。

大多數環狀RNA位于外顯子(46 549)，其次是內含子(4759)、基因間(1155)和反義(455)。圖形1C)。與在CircAltas數據庫中報道的已知的豬環狀RNA相比，發現41.12%(21761/52918)已鑒定的環狀RNA是新發現的，這大大擴展了豬的環狀RNA種類。圖形 1D, 表 S3)。性狀分析表明，外顯子環狀RNA的中位外顯子數目和長度為4。圖形 1E)和581 bp(圖形 1F)分別與以前關于豬的報道相似。同時，72.76%(5312/7301)的寄主基因能產生至少2個轉錄因子。圖形 S2A)。雖然大多數cRNA的表達僅限于樣本的一個子集，但作者觀察到了crna的一個子集(n在骨骼肌中廣泛表達(至少在80%的樣本中)圖形 S2B)。注意到環狀RNA基因體的甲基化水平高于鄰近區域。有趣的是，在BSJ站點周圍觀察到明顯的甲基化(數字 1g和S3)。隨后分別鑒定了豬與人之間以及豬與小鼠之間的12677和4792保守的環狀RNA。其中，2916個環狀RNA在豬、人和小鼠(表 S2)。

圖1：豬骨骼肌環狀RNA的鑒定及特性研究

2、環狀RNA在骨骼肌發育過程中的動態時間調控

（這是在暗示，你的長大離不開中這個環狀RNA，好跟你講環狀RNA和發育生長的故事~）

鑒定了9848-19506個circRNA在每個骨骼肌中的表達，其中產前表達的circRNA比出生后的多。圖形 2A)。基于circRNA表達的聚類分析清楚地將骨骼肌標本分為產前和產后兩組(圖形 S4)。主成分分析(PCA)顯示，在骨骼肌發育過程中，從胚胎階段到成體階段，環狀RNA的表達具有高度的發育依賴性。圖形 2B)。這些結果表明，在骨骼肌發育過程中，環狀RNA是以時間依賴的方式動態表達的。

為了檢測骨骼肌發育過程中受到時間調節的circRNA，在任何兩個階段(Log)共鑒定了7198個差異表達的ccRNAs(Decs)。2FC≥1和FDR≤0.0 5；表 S4，占所有表達的crcRNA的13.60%(7198/52918)。圖形 2C)。與外顯子非dc相比，外顯子decs有更短的轉錄本長度(圖形 二維空間)和較低的外顯子數(圖形 2E)。隨后，進行了wgcna共表達網絡分析。重點關注這些DES，并揭示了七個不同的共表達模塊(m1-M7；表 S4)。三組細胞(M2、M3和M6)在骨骼肌發育過程中表現出動態的時間表達。圖形 2F)。在產前階段，M2和M3簇中的環狀RNA大量表達。隨著骨骼肌的發育，M2區轉錄因子的表達逐漸增加，而M3區的表達逐漸下降。基因本體論(GO)富集分析表明，M2中的宿主基因被富集為與細胞定位和增殖相關的GO類。圖形 2G)。M3宿主基因在胚胎形態發生、神經系統發育和細胞分化過程中起重要作用。圖形 2H)。M6主要表達于生后階段，在生后骨骼肌發育過程中表達上調。

                      圖2：環狀RNA在豬骨骼肌發育過程中的動態表達

3、CircFgfr2高度保守，是骨骼肌發育的候選調節因子

（藏得這么深，還不是被我發現了，CircFgfr2）

為了進一步鑒定可能參與心肌發生的環狀RNA，對在生長培養基(GM)和分化培養基(DM)中培養的小鼠C2C12成肌細胞進行了微陣列分析。與在gm中培養的成肌細胞相比，在dm中培養的成肌細胞中有66個cRNA表達上調(Log)。2FC≥1和FDR≤0.0 5；圖形 3A和表 S5)。利用發散引物rt-qPCR成功地驗證了6個上調的環狀RNA。圖形 3B)，表明這些DES對進一步的分析是可靠的。在66個環狀RNA中，6個與豬環狀RNA相同，包括4個在豬骨骼肌發育過程中差異表達的環狀RNA(CircFgfr2、CircQrich1、CircMettl9和CircCamta 1)，表明這些環狀RNA可能以保守的方式調控哺乳動物骨骼肌的發育。

在這四個保守的DECs中，CircFgfr2引起了作者的興趣。成纖維細胞生長因子受體2(FGFR 2)的宿主基因對骨骼肌的維持和修復至關重要。CircFgfr2是由小鼠線性序列外顯子3-6生成的穩定的外顯子環狀RNA。Sanger測序驗證了環狀Fgfr2的BSJ序列。圖形 3C)，rnase R處理RNA中crcFgfr2的RT-PCR結果表明，crcFgfr2具有抗消化能力，具有閉環結構。圖形 三維空間)。保守性分析表明，環狀Fgfr2的BSJ序列在人類、小鼠、豬和雞中高度保守。圖形 S5).

作者研究了幾種肌發生系統的時間表達模式。在新生期小鼠TA肌中具有豐富的CircFgfr2表達，在出生后發育過程中其表達水平明顯下降(P<0.01)。圖形 3E)。在C2C12細胞分化過程中，cycFgfr2的表達在分化后的前4天呈時間依賴性增加。圖形 3F)。同時，利用建立的CTX誘導的骨骼肌損傷和再生模型。圖形 S6)，作者發現在傷后的前2天，cycFgfr2的表達明顯增強，隨后下降。圖形 第三代)。然而，CircFgfr2的時間表達模式與FGFR 2的表達模式無關。圖形 S7)。同時，rt-qPCR分析顯示crcFgfr2在快速抽搐的股四頭肌中富集，而不是在緩慢抽搐的比目魚肌中富集。圖形 3H)，提示不同纖維類型的骨骼肌cycFgfr2的差異表達可能取決于它們的代謝狀態。基于FISH和染色質分餾實驗的亞細胞定位分析表明，CircFgfr2主要分布在細胞質中。圖形 3I-3K)。綜上所述，這些數據表明crcFgfr2是一種潛在的調節肌發生和肌肉再生的周期RNA。

圖3. CircFgfr2高度保守，是骨骼肌發育的候選調節因子

4、CircFgfr2抑制成肌細胞增殖，促進成肌細胞分化和肌肉再生

（沒錯，它就是讓你變強壯的小可愛）

為了探討circFgfr2在小鼠成肌過程中的作用，作者首先研究了CircFgfr2是否影響小鼠成肌細胞的增殖和分化。轉染小鼠原代成肌細胞cycFgfr2-過表達載體和siRNAs。過表達載體(plCDH-CircFgfr2)和三種siRNAs(si-cycFgfr2-1，-2和-3)均能有效地改變cycFgfr2(圖形 S8)，對線性的表達沒有顯著影響。FGFR 2MRNA(圖形 S8c和S8F)。在這三種siRNAs中，si-CircFgfr2-1的干擾效率最高，并被選擇用于后續分析。圖形 S8E)。

在小鼠原代成肌細胞和C2C12成肌細胞中，乙炔基-2‘-脫氧尿苷(EDU)摻入法和CCK-8法均顯示過表達過表達的cycFgfr2可降低細胞增殖活性。數字 4A, 4B，和中9)，在擊倒CircFgfr2之后，觀察到了相反的效果。圖形 中9)。CycFgfr2的過表達在mRNA和蛋白水平上均顯著降低了增殖標記物的表達。圖形 4C和4D)，而crcFgf 2的基因敲除顯著上調了這些基因的表達(圖形 S9G和S9H)。細胞周期分析顯示，過表達的cyclcFgfr2增加了G0/G1期的細胞數，減少了進入S期的細胞數(圖形 4E和4F)，在Fgfr2擊倒后觀察到相反的效果。圖形 S9I和S9J)。同時，cycFgfr2的過表達促進了肌原性分化，表現為mhc 1、myoD和myogenin在兩種mRNA上的表達增加。圖形 4G)和蛋白質水平(圖形 4H)，免疫熒光檢測證實crcFgfr2的過表達促進了MyHC的表達。圖形 4I)和肌管的形成。定量分析結果表明，與對照組相比，crcFgfr2高表達組出現的肌管較多，有多個肌核。圖形 4J)。相反，Fgfr2基因敲除后，成肌細胞分化受到明顯抑制。圖形 S9K–S9N)。

鑒于CircFgfr2參與了心肌的發生(圖形 3E-3G)，作者假設CircFgfr2也在肌肉再生中起作用體內。為驗證這一結論，給C57BL/6小鼠的TA肌肉注射腺病毒介導的CircFgfr2-過表達載體(AAV-CircFgfr2-OV)和對照組(AAV-CircFgfr2-NC)。正如預期的那樣，28天后與對照組相比，CircFgfr2的表達顯著上調(P<0.05)。數字 4K和S10A–S10c)。隨后，CTX在同一地點肌肉注射(圖形 4K第3天，HE和免疫熒光染色顯示AAV-CircFgfr2-OV小鼠肝纖維化/壞死明顯減少(圖形 S10D)。AAV-CircFgfr2-OV抑制損傷區單核細胞的積累。圖形 S10D)。同時，作者觀察到AAV-CircFgfr2-OV組MyoD和Pax7的表達明顯高于AAV-CircFgfr2-NC組(P < 0.05; 圖形 S10E–S10G)。注射CTX 5天后，如預期的那樣，形成了新的含有中央核的肌纖維來修復受損的纖維(數字 4L和S6)。與AAV-CircFgfr2-NC組相比，AAV-CircFgfr2-OV可上調TA肌肉中肌原素的表達，并能刺激CTX注射后5天內新肌纖維的生長。圖形 4K和4m)。AAV-CircFgfr2-OV處理的肌肉肌纖維大小增加，而對照組肌肉中仍存在豐富的單核細胞。數字 4N和S10H)。AAV-CircFgfr2-OV組新生肌纖維的橫截面積明顯大于對照組。圖形 4O)。綜上所述，這些結果提示環狀Fgfr2抑制成肌細胞的增殖，促進成肌細胞的分化和肌肉再生。

圖4.CrcFgfr2抑制成肌細胞增殖，促進成肌細胞分化和肌肉再生

5、CircFgfr2通過海綿miR-133調節map3k20

（CircFgfr2牽起miR-133的手，告訴map3k20你可以放肆生長）

為了確定cyclcFgfr2在肌發生和肌肉再生中的調節機制，作者首先評估了在轉錄本中具有潛在結合位點的miRNAs，以及TargetScan預測的16個miRNAs。35和miRDB36節目。用熒光素酶報告法對16種miRNA模擬表達的HEK293T細胞進行了熒光素酶報告試驗，驗證了它們之間的相互作用。作者發現，三個miR-133家族成員(miR-133 a-3p、133 b-3p和133 c)是顯著降低熒光素酶強度的前三位miRNAs。圖形 5A和5C)，雖然它們沒有抑制突變的miR-133結合位點的記者的熒光素酶活性(圖形 5B和5C)。同時，miR-133的過表達顯著降低了CircFgfr2的表達。圖形 5D)，過表達的cycFgfr2顯著降低miR-133的豐度(圖形 5E)。接下來，作者進行了基于RISC的核心蛋白Argonaute-2(Ago 2)的RIP，然后用RT-qPCR來檢測Ago2是否能降低C2C12細胞的CircFgfr2和miR-133。正如預期的那樣，在Ago 2拉下樣本中，CircFgfr2和miR-133有顯著的富集(圖形 5F)，提示cycFgfr2通過Ago 2蛋白與miR-133密切相互作用。此外，miR-133的過表達還能有效地提高cycFgfr2過表達對成肌細胞增殖的抑制作用。圖形 5G)，干擾miR-133模擬物可抑制crfgfr2基因敲除對成肌細胞增殖的促進作用。圖形 5H)。這些發現有力地表明，CircFgfr2是miR-133家族成員的直接靶點。

然后，作者探討了miR-133家族和CircFgfr2調控心肌發生的機制。Map3k20是TargetScan預測的miR-133家族成員的目標。35和miRDB36節目(圖形 5I)。熒光素酶報告試驗顯示，miR-133的過表達顯著抑制野生型map3k20 3‘UTR報告者的熒光素酶活性，而當相應的結合位點發生突變時，這種抑制作用被消除。圖形 5J)。在骨骼肌再生過程中，map3k20與miR-133呈負相關，與CircFgfr2表達呈正相關(P < 0.05; 圖形 5K)。亞細胞定位分析表明，miR-133和map3k20主要分布在胞漿中，與CircFgfr2相似。圖形 5L)。同時，miR-133家族成員的過度表達導致map3k20的表達下降，而敲降則顯著上調了map3k20的表達。圖形 五米和5N)。作者觀察到map3k20的過表達能有效地逆轉miR-133模擬物對MyHC 1表達的抑制作用。圖形 5o)。此外，map3k20的基因敲除抑制成肌細胞的增殖，促進分化，與cyclcFgfr2在肌細胞發生過程中的作用相一致。圖形 S11)，而在map3k20過表達(圖形 S11)。這些結果表明，CircFgfr2作為miR-133家族海綿，在肌發生和肌肉再生過程中促進Map3k20的表達。

圖5：CircFgfr2通過海綿miR-133家族成員促進Map3k20的表達

6、大體積和單細胞rna-seq顯示環狀fgfr2調節jnk/MAPK信號通路的活性

（找到了CircFgfr2實際是通過調節jnk/MAPK信號通路，來調節肌肉的發育和再生）

Map3k20是調控JNK/MAPK信號通路的上游因子之一。鑒于CircFgfr2通過海綿miR-133調節Map3k20的表達，作者推測CircFgfr2可能通過JNK/MAPK信號通路調控骨骼肌的發育。為了解決這一問題，作者首先研究了cycFgfr2過表達后增殖的C2C12細胞中多聚(A)RNA-seq的全局轉錄組的變化。與對照組相比，2798個基因在過表達cfgfr2后上調。圖形 6A, 表 S6)。富集分析表明，與細胞周期相關的GO類和與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號相關的KEGG通路，上調的基因明顯富集。圖形 S12)。MAPK信號通路的關鍵基因被上調(圖形 6B)。Rt-qPCR分析證實MAPK通路的基因在過表達cFgfr2后上調。圖形 6C)。同時，對C2C12細胞的Westernblotting分析表明，過表達過高的cyclcFgfr2可使map3k20、p-MKK7和p-JNK在兩種細胞增殖過程中表達顯著增加。圖形 6d)和分化(圖形 6E)階段。為了進一步證實crcFgfr2在JNK/MAPK通路中的調節作用，作者在注射CTX后第5天對AAV-CircFgfr2-OV處理的肌肉進行了單細胞RNA-seq(scRNA-seq)分析(10×基因組)。經質量控制后，共保留了67121個細胞(表 S7)和9種細胞類型通過t-SNE聚類和注釋(圖形 6f)。AAV-CircFgfr2-OV組肌肉干細胞中MyoD、Myh 4、Myf 5和Pax7的表達水平均高于對照組(P<0.01)。圖形 6g)。同時，在肌肉相關細胞類型的肌重塑過程中，過表達的cyclcFgfr2激活了JNK通路中map3k20和其他關鍵基因的表達Fig6。這些結果表明，CircFgfr2通過激活JNK/MAPK通路，調節肌肉的發育和再生。

圖6：大體積和單細胞RNA-seq揭示了CircFgfr2調節JNK/MAPK信號通路的活性

7、KLF 4目標環Fgfr2通過負反饋環

（作者提出了一種由circFgfr2介導的肌生成調控模型，該模型由Klf 4調控，作為miR-133的誘餌，以減輕其對Map3k20的抑制作用，激活JNK/MAPK信號通路。JNK信號的激活抑制Klf 4的轉錄和轉活化活性，最終在肌發生和肌肉再生過程中形成一個自我調節的反饋環。）

接下來，作者預測轉錄因子(TFs)可能與FGFR 2啟動子結合使用

Jaspar(Http://jaspar.genereg.net)。在預測的tfs中，klf 4引起了作者的注意，因為有報道說它能促進肌肉細胞的分化、骨骼肌再生。在環狀Fgfr2啟動子中存在多個可能的Klf 4結合基序。圖形 7A)。作者克隆了三個包含這些結合位點(B1-B3)的連續區域，并構建了一系列熒光素酶報告載體。圖形 7b)。結果表明，Klf 4對B2和B3啟動子的熒光素酶活性有促進作用，但對B1啟動子(圖形 7C)。作者構建了Klf 4過表達載體，并在蛋白質水平上證實了其作用。圖形 S13A)。Klf 4的過表達顯著上調了線性FGFR 2 mRNA和circFgfr2的表達。數字 7D和S13A)。此外，芯片-qPCR分析表明，Klf 4能與環狀Fgfr2啟動子的B3結合。圖形 7E)。這些數據表明CircFgfr2是Klf 4的直接目標。

已有研究表明，JNK信號的激活和Klf 4的磷酸化抑制Klf 4的轉錄和轉活化活性。同時，據報道JNK/MAPK信號通路對肌源性分化有積極的調節作用。41因此，結合作者的研究結果，作者提出了一種由circFgfr2介導的肌生成調控模型，該模型由Klf 4調控，作為miR-133的誘餌，以減輕其對Map3k20的抑制作用，激活JNK/MAPK信號通路。JNK信號的激活抑制Klf 4的轉錄和轉活化活性，最終在肌發生和肌肉再生過程中形成一個自我調節的反饋環。圖形 7F).

圖7：G3BP1和Klf 4是CircFgfr2的上游調控因子

8、G3BP1調控環狀Fgfr2的生物發生

為了探討環狀Fgfr2在骨骼肌發育過程中的生物發生機制，作者分析了rna結合蛋白(rna bindingprotein，RBPs)在crcFgfr2的典型前mRNA中的可能結合位點。預測了6個可能的G3BP1結合位點，2個上游和4個下游。圖形 7g)通過catRAPID。42GTPase激活蛋白(SH3結構域)結合蛋白1(G3BP1)被報道為一種內源性內切酶，通過與其同源序列結合而選擇性地靶向基因。RT-qPCR結果顯示，G3BP1的過度表達在mRNA水平上顯著上調了G3BP1的表達。圖形 S13B)和下調環狀Fgfr2的表達，線性FGFR 2C2C12成肌細胞中的mRNA和miR-133家族數字 7H, S13B，和S13C)。RIP證明，G3BP1可以通過這些推測的上游和下游結合位點，通過一種抗G3BP1抗體與環狀Fgfr 2前mRNA結合。圖形 7I)。此外，westernblotting結果表明，cycFgfr2過表達可促進成肌細胞分化蛋白的表達，這種作用可通過與G3BP1過表達載體共轉染C2C12細胞來逆轉。圖形 7J)。因此，G3BP1與CircFgfr2直接結合，并抑制其生物發生，從而調節肌肉的發育。

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