Co-IP免疫共沉淀實操注意事項【附操作視頻】
來源/作者:普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺
CO-IP實驗操作注意事項由普拉特澤生物旗下科研培訓品牌——《春風學院》為大家總結分享,普拉特澤生物分子檢測平臺專門承接Co-IP免疫共沉淀實驗服務,自成立至今接受Co-IP外包幾百例,積累了大量的實操經驗和避免實驗誤差意外的注意事項,今天小編就把這些Co-IP結果完美的獨門秘籍傳授給大家吧!文尾更附有Co-IP實驗操作視頻教程,快來學習吧!
免疫共沉淀是一種以抗體和抗原識別專一性為基礎,用于研究蛋白質相互作用的經典方法。我們在進行實驗的操作時要注意的有:
1、樣品制備時要注意:細胞裂解要采用溫和的裂解條件,避免破壞細胞內存在的蛋白間相互作用,裂解、洗滌時需使用非變性裂解液。此外,由于不同細胞裂解條件不一樣,建議通過預實驗來確定最佳條件。
2、抗體固定時要注意的是:抗體的選擇十分重要,選經過 IP 驗證的抗體,可以減少假陽性概率。同時,要注意抗體/緩沖液的比例,抗體稀釋過度不利于后續抗原抗體結合;而抗體過多就不能完全沉降在固相基質上,殘存于上清。操作時,為了避免損傷 beads,使用大口徑或截短槍頭進行加樣。
3、免疫共沉淀操作時要注意的是:增加在洗脫之前的洗滌次數或在免疫共沉淀緩沖液中加入 Triton X-100 ,可以降低非特異性結合,以防止蛋白在陰性對照樹脂實驗樣品中被檢測到。
確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,而并非外源非特異蛋白,單克隆抗體的使用有助于避免污染的發生。
4、洗脫與檢測時要注意的是:如后續需進行酶活或功能性分析,則需使用兼容下游檢測的 Elution buffer 進行洗脫。對于交聯劑結合的 beads,為了保持抗體偶聯樹脂的活性,應立即再生和存儲樹脂,保證抗體可以重復利用。
那么Co-IP實驗的注意事項我們就講完啦,想要學習更詳細的Co-IP實驗過程的同學歡迎點擊《Co-IP 理論+實操》自行學習哦。