構(gòu)建shRNA序列設(shè)計流程
2024-09-19 17:23:12
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺
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構(gòu)建shRNA序列設(shè)計流程是一個精細且多步驟的過程，旨在優(yōu)化基因表達調(diào)控。
以下是一個詳細的構(gòu)建流程，涵蓋了從目標基因選擇到shRNA序列驗證的各個環(huán)節(jié)：
一、目標基因選擇與shRNA設(shè)計
①?明確目標基因?：
確定需要調(diào)控的目標基因及其在細胞或組織中的功能。
?②選擇靶序列?：
利用在線工具（如RNAi Design Tool、Sigma Aldrich的shRNA設(shè)計工具等）預(yù)測并篩選潛在的靶序列。
選擇保守性高、特異性強的靶序列，避免高GC含量或富含重復(fù)序列的區(qū)域。
?③設(shè)計shRNA序列?：
設(shè)計兩個短反向重復(fù)序列，中間由一個莖環(huán)（loop）序列分隔，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
常用的莖環(huán)序列包括5'TCAAGAG3'，但也可以嘗試其他序列以優(yōu)化效果。
在shRNA序列的尾部加入5-6個T作為RNA聚合酶III的轉(zhuǎn)錄終止子。
圖1
二、shRNA序列合成與克隆
?①序列合成?：
將設(shè)計好的shRNA序列進行化學(xué)合成，或通過合成兩段互補的寡核苷酸并通過退火形成雙鏈DNA。
?②選擇載體?：
選擇合適的表達載體，如質(zhì)粒載體、慢病毒載體或腺病毒載體等。
確保載體具有有效的啟動子（如U6、H1等）以驅(qū)動shRNA的轉(zhuǎn)錄。
③克隆shRNA序列?：
通過限制酶消化和連接酶反應(yīng)將shRNA序列克隆到載體的多克隆位點上。
確保shRNA序列的兩端帶有適當?shù)拿盖形稽c以便于連接。
圖2
三、載體構(gòu)建與驗證
Ⅰ菌落PCR?：
通過菌落PCR初步篩選陽性克隆。
Ⅱ酶切映射?：
使用特定的酶切位點進行酶切映射，進一步確認shRNA序列的正確插入。
Ⅲ測序驗證?：
對陽性克隆進行測序，確保shRNA序列的正確性和完整性。
圖3
四、細胞轉(zhuǎn)染與功能驗證
?㈠細胞轉(zhuǎn)染?：
將構(gòu)建好的shRNA表達載體通過轉(zhuǎn)染方式引入適當?shù)乃拗骷毎小?/span>
優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件以提高轉(zhuǎn)染效率。
㈡功能驗證?：
使用qRT-PCR或Western Blot等方法檢測目標基因的表達水平，以評估shRNA的干擾效率。
通過流式細胞術(shù)或其他方法檢測細胞表型變化，以進一步驗證shRNA的功能
五、優(yōu)化與調(diào)整
?Ⅰ多靶點設(shè)計?：
針對同一基因設(shè)計多個shRNA序列，以提高基因沉默的效率和特異性。
Ⅱ組合干擾?：
將多個針對不同基因的shRNA序列組合使用，以實現(xiàn)更復(fù)雜的基因表達調(diào)控。
?Ⅲ細胞類型特異性?：
根據(jù)目標細胞的特性選擇合適的啟動子和載體類型，以提高shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和穩(wěn)定性。
——通過以上流程，可以構(gòu)建出高效、特異的shRNA表達載體，為基因表達調(diào)控研究提供有力的工具。
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