GST pulldown實驗步驟——看完就會
2023-04-04 13:27:09
來源/作者：普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺
普拉特澤生物分子檢測平臺專業為大家提供GST pulldown檢測外包服務，提供真實、高質量的實驗結果。現在我們來跟著技術來看看GST pulldown實驗的操作步驟吧！
GST pulldown實驗是一種常用的蛋白質相互作用分析方法，適用于研究兩個或多個蛋白質之間的直接或間接相互作用關系。該方法利用融合的GST標簽對目標蛋白進行親和層析分離，從而實現目標蛋白和與其相互作用的蛋白的純化和鑒定。
本文將介紹GST pulldown實驗的詳細步驟，包括蛋白表達、親和層析、洗滌、洗脫和分析等方面。
GST標簽蛋白的表達
首先需要在目標蛋白上克隆GST標簽，以便后續實驗中使用。可以通過PCR擴增、限制性內切酶消化和連接、質粒轉染等方法將GST標簽與目標蛋白融合。融合蛋白的表達可以使用大腸桿菌等表達宿主，根據融合蛋白的大小和目的選擇合適的表達載體和表達條件。
GST融合蛋白的純化
將GST融合蛋白表達至一定的濃度后，可進行蛋白質的純化。GST融合蛋白的純化可以使用GST樹脂，將蛋白質加入含有GST樹脂的層析柱中，再使用洗脫緩沖液進行洗脫。此時，GST融合蛋白會在GST樹脂上發生親和作用，從而實現純化。純化的GST融合蛋白可以通過SDS-PAGE凝膠電泳進行檢測，檢查其純度和完整性。
靶蛋白的制備
制備靶蛋白可以使用細胞質提取物、重組蛋白等樣品。為了便于后續的GST pulldown實驗，需要在靶蛋白上標記親和標簽，例如Flag標簽、His標簽等。標記的靶蛋白可以通過SDS-PAGE凝膠電泳和Western blot檢測，檢查其純度和標記效果。
GST pulldown實驗
將純化的GST融合蛋白加入含有靶蛋白的細胞質提取物中，使其在一定的條件下相互作用，然后進行親和層析分離，分離出與GST融合蛋白結合的復合物。
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