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    普拉特澤生物為廣大生命科學(xué)研究人員提供wb實(shí)驗(yàn)，可根據(jù)實(shí)方案的要求選擇不同的檢測(cè)方法，本文就跟大家一起繼續(xù)探究跑磷酸化蛋白WB的硬核技巧有哪些~

1 實(shí)驗(yàn)概述

蛋白質(zhì)磷酸化屬于蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在探究某條通路例如MAPK或者NF-κB通路的激活情況，利用蛋白質(zhì)免疫印記技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白質(zhì)（p-p38、p-p65、p-IκB）磷酸化的相對(duì)水平，可以分析細(xì)胞對(duì)于外界刺激的做出變化。而Western Blot檢測(cè)磷酸化蛋白通常會(huì)出現(xiàn)條帶模糊、或多雜帶等難點(diǎn)，存在許多需要注意的方面。因此，下面主要對(duì)跑磷酸化蛋白的難點(diǎn)進(jìn)行分析和一些經(jīng)驗(yàn)分享：

圖片來源：https://www.bioradiations.com/10-tips-for-western-blot-detection-of-phosphorylation-events/

2 磷酸化蛋白WB的難點(diǎn)

1. 細(xì)胞樣本的預(yù)處理

• 問題1：磷酸化狀態(tài)容易發(fā)生改變，通常地，當(dāng)我們用裂解液裂解細(xì)胞之后，分離出包含磷酸化蛋白的總蛋白，但此時(shí)由于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變磷酸酶容易被激活，進(jìn)一步導(dǎo)致磷酸化蛋白發(fā)生去磷酸化。

• 解決辦法：在細(xì)胞裂解時(shí)，除了添加蛋白酶抑制劑，裂解液還要按照比例添加磷酸酶抑制劑。

• 問題2：細(xì)胞受刺激后激活相關(guān)通路，促使蛋白發(fā)生磷酸化；此時(shí)磷酸化蛋白的含量相對(duì)而言是比較低的，如何獲取足夠的蛋白上樣量。

• 解決辦法：首先是保證蛋白的有效提取，將細(xì)胞和裂解液混合物收集至離心管后立即置于冰上裂解15min，然后用超聲細(xì)胞破碎儀充分裂解細(xì)胞。離心收集上清后，為了保證磷酸化的完整性和活性，一般現(xiàn)提現(xiàn)用，比普通蛋白的保存要求更高，因此上樣的蛋白盡量要新鮮。

2. 選擇性價(jià)比高的抗體

• 問題1：如何快速定位和選擇合適的抗體？ 

• 解決辦法：通過查閱文獻(xiàn)確定目的蛋白磷酸化位點(diǎn)或者直接通過已知文獻(xiàn)確定抗體的購買來源、選擇知名品牌或經(jīng)過驗(yàn)證的磷酸化特異性抗體，比較磷酸化蛋白的效價(jià)如何。

  另外，選擇性價(jià)比高的抗體，例如售后服務(wù)較好、可以試用、顯影條帶清晰、價(jià)格合適，通常磷酸化抗體比普通抗體而言可能會(huì)貴一點(diǎn)，可以選擇抗體有活動(dòng)時(shí)購買。另外，針對(duì)磷酸化蛋白的抗體需要具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確識(shí)別目標(biāo)蛋白上特定的磷酸化位點(diǎn)；若存在特異性不好的情況，就可能與非磷酸化蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性。

3. 優(yōu)化膜的封閉和顯影

• 問題：封閉背景高，顯影時(shí)出現(xiàn)大片黑色或黑色小點(diǎn)；條帶不明顯、沒有條帶或者條帶彌散；條帶數(shù)量多不能準(zhǔn)確定位蛋白位置。

• 解決辦法：對(duì)于磷酸化抗體來說5%BSA封閉液的封閉效果可能比5%的脫脂奶粉效果更好一些。通常實(shí)驗(yàn)室購買的脫脂奶粉中可能會(huì)含有磷酸酶，孵育時(shí)就可能對(duì)磷酸化的蛋白產(chǎn)生降解。

  由于磷酸化蛋白本身含量較低，因此要保證上樣量足夠、上樣蛋白新鮮，顯色時(shí)才能出現(xiàn)條帶，另外若是曝光時(shí)間足夠長（超過1min卻一點(diǎn)條帶都沒有）,就可能說明上述兩個(gè)問題。另外抗體本身效果不好、特異性差、封閉不好就會(huì)出現(xiàn)條帶數(shù)量多無法確定正確條帶的位置。

4. 分析條帶

• 問題：磷酸化蛋白到底是一個(gè)條帶還是兩個(gè)條帶，磷酸化是否是需要跑總蛋白，定量時(shí)如何分析。

• 解決辦法：條帶的數(shù)量取決于磷酸化位點(diǎn)的數(shù)量和狀態(tài)，因此在購買抗體時(shí)我們就要確定好磷酸化位點(diǎn)，若蛋白具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，這些磷酸化蛋白在電泳時(shí)遷移率就可能不同，若是一個(gè)蛋白存在兩種不同的磷酸化形式且分離效果不一致此時(shí)就可能出現(xiàn)兩個(gè)條帶，相反就只有一個(gè)條帶。另外一種簡單的方法就是直接通過查閱文獻(xiàn)確定磷酸化位點(diǎn)和抗體購買來源，根據(jù)抗體說明書確定條帶數(shù)目。

  
  

  通常地，磷酸化蛋白的檢測(cè)需要設(shè)置兩個(gè)內(nèi)參，一個(gè)是普通內(nèi)參例如常用的GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）或者β-actin（β-肌動(dòng)蛋白）而另一個(gè)就是磷酸化蛋白對(duì)應(yīng)的總蛋白。普通內(nèi)參是作為實(shí)驗(yàn)組的對(duì)照，保證上樣量一致的同時(shí)排除實(shí)驗(yàn)本身的影響。例如分析PI3K/AKT通路，檢測(cè)AKT磷酸化蛋白的同時(shí)也需要檢測(cè)其總蛋白水平；因?yàn)閮H僅檢測(cè)到其磷酸化蛋白表達(dá)量發(fā)生變化不能充分說明問題，此時(shí)需要比較磷酸化蛋白與總蛋白的比值，比值變化表達(dá)了磷酸化水平發(fā)生相對(duì)變化。

圖片來源：https://azurebiosystems.com/product/western-blot-box/

3 注意事項(xiàng)

（1）由于磷酸化蛋白的量相對(duì)較少，因此接種細(xì)胞時(shí)，要保證足夠的細(xì)胞數(shù)量6孔板一般1×10⁶~4×10⁶個(gè)/孔。

（2）超聲破碎時(shí)，要控制超聲的功率、時(shí)間間隔；超聲間歇可置于冰上降溫，避免長時(shí)間超聲造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞和磷酸化位點(diǎn)丟失。例如設(shè)置程序共計(jì)破碎次數(shù)：80~100次，破碎3s，停3s。1管細(xì)胞破碎20次左右，破碎過程發(fā)熱置于冰上冷卻5s。

（3）磷酸酶抑制劑可加入如NaF、Na3VO4、β-甘油磷酸鈉或者直接購買商用的蛋白酶、磷酸酶抑制劑，以最大程度抑制磷酸酶活性，防止磷酸化蛋白去磷酸化。

（4）使用新鮮的轉(zhuǎn)膜液有助于提高轉(zhuǎn)膜效率和蛋白與膜的結(jié)合力。

（5）曝光時(shí)間要根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)整，可從短時(shí)間（如0.5~10s）開始嘗試，逐漸增加曝光時(shí)間，以獲得清晰且背景低的條帶圖像。

（6）磷酸化蛋白的條帶數(shù)參考抗體說明書。

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