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一、β-乳糖苷酶染色實驗簡介與原理

實驗簡介： β -半乳糖苷酶是一種是細胞溶酶體中的水解酶，能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶。其結構基因為LacZ，與LacY（半乳糖苷透性酶）和LacA（半乳糖苷轉乙酰酶）同組成乳糖操縱子，并在特異的乳糖操縱系統中的阻遏物、操縱基因、啟動子等的協同下，支配調節β-半乳糖苷酶的合成。β-半乳糖苷酶一般廣泛存在于動植物界中。

實驗原理：絕大多數正常細胞被認為僅有有限的分裂能力，在不能分裂后就進入衰老(senescence)狀態。此時細胞仍然是存活的，但細胞的基因和蛋白的表達譜發生了很大改變。衰老的細胞不能在一些常規的刺激下再誘導細胞分裂，并且衰老細胞的細胞周期分布也比較特殊，不同于一些損傷誘導的細胞休眠，也不同于細胞生長接觸抑制的情況。衰老細胞通常體積變大，并表達在pH6.0時有高酶活性的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。

二、β-乳糖苷酶染色臨床意義

在臨床上，β半乳糖苷酶，在腎近曲小管上皮細胞中含量較高。尿中β半乳糖苷酶活性可反映腎實質，特別是腎小管的早期損傷，與尿中N-乙酰β-D-氨基葡糖苷酶一同測定作尿酶譜分析，有助于病程觀察和預后評價。如對各種腎病的鑒別診斷、藥物對腎的毒性作用、感染、休克、腎移植排異反應、急性腎小管壞死等疾病的早期監測等。衰老相關β -半乳糖苷酶染（senescenceassociatedb-galactosidase SA -β-Gal）：體外培養細胞在 p H 為 6 時 , 其β-半乳糖苷酶染色的陽性率隨代齡增加而增加 , 這種中性β 2 半乳糖苷酶被定義為衰老相關的β-半乳糖苷酶 ( SA 2 β 2 gal) 。血清饑餓引發的生長抑制并不能提高 SA 2 β 2 gal 的活性 ,Werner 綜合癥患者皮膚成纖維細胞體外培養時增殖能力的喪失快于正常人 ,同時 ,SA 2 β 2 gal 陽性細胞的積累速度也加快。永生化細胞檢測不到 SA 2 β 2gal 的活性 , 轉基因技術誘導永生化細胞衰老的同時 ,也誘導衰老相關β 2 半乳糖苷酶的活性。而且 ,老年個體皮膚組織切片衰老相關β 2 半乳糖苷酶染色的陽性率高于年輕個體。基于以上觀察 ,人們認為這種中性β 2 半乳糖苷酶是一種很好的可用于體內外衰老研究的生物學標志。

三、β-乳糖苷酶染色實驗步驟（樣本與實驗目的不同步驟均有不同）

Step1：將石蠟組織切片置于65°C恒溫箱，烤片1h左右

Step2：脫蠟。二甲苯I10min→二甲苯II10min→梯度酒精(由高到低)各5min

Step3：1xPBS洗滌3次，每次5min。注：對于冷凍切片直接按照以下步驟進行

Step4：加入適當體積的-半乳糖苷酶染色固定液，以充分蓋住組織為宜，室溫固定不少于15min

Step5：1xPBS洗滌3次，每次5min

Step6：加入適當量的染色工作液

Step7：37℃孵育過夜，最好把整個切片浸泡在染色工作液中。注：37℃孵育不能在二氧化碳培養箱中進行。

Step8：1xPBS洗滌3次，每次5min

Step9：脫水:梯度酒精(由低到高)各5min→二甲苯I10min→二甲苯II10min

Step10：加上封片液封片后4℃可以保存較長時間

Step11：普通光學顯微鏡下觀察。光學顯微鏡下很容易觀察到變成藍色的表達-半乳糖苷酶的細胞