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        今天給大家分享的就是Southern Blot印跡雜交實驗操作詳細步驟，上期我們在Southern Blot實驗介紹中簡單介紹了一下關于Southern Blot實驗的操作步驟，本文就給大家詳細講講實際操作中的各種細節，讓你看完即會！不會普拉特澤幫你做，教你會！

        一、 Southern Blot待測核酸樣品的制備

        1、制備待測DNA

        基因組DNA是從動物組織（或）細胞制備。1.采用適當的化學試劑裂解細胞，或者用組織勻漿器研磨破碎組織中的細胞；2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白質和RNA；3.用有機試劑（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白質。

        2、 DNA限制酶消化

        基因組DNA很長，需要將其切割成大小不同的片段之后才能用于雜交分析，通常用限制酶消化DNA。消化DNA后，加入EDTA，65℃加熱滅活限制酶，樣品即可直接進行電泳分離，必要時可進行乙醇沉淀，濃縮DNA樣品后再進行電泳分離。

        二、 瓊脂糖凝膠電泳分離待測DNA樣品

        1. 制備瓊脂糖凝膠，盡可能薄。

        2. 分子質量標志物（DIG標記）上樣。

        3. 電泳，使DNA條帶很好的分離。

        4. 評價靶DNA的質量。在電泳結束后，0.25-0.50μg/mlEB染色15-30min，紫外燈下觀察凝膠。

        三、電泳凝膠預處理

        1. 如果靶序列>5kb，則需進行脫嘌呤處理。          

        (1) 把凝膠浸在0.25mol/L HCl中，室溫輕輕晃動，直到溴酚藍從藍變黃。

        注意：處理人類基因組DNA≤10分鐘；處理植物基因組DNA≤20分鐘。

        (2) 把凝膠浸在滅菌雙蒸水中

        2. 如果靶序列<5kb，則直接進行下面的步驟

        (1) 把凝膠浸在變性液（0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl）中，室溫2×15分鐘，輕輕晃動。

        (2) 把凝膠浸在滅菌雙蒸水中

        (3) 把凝膠浸在中和液中（0.5mol/L Tris-HCl，pH7.5，1.5mol/L NaCl），室溫2×15分鐘。

        (4) 在20×SSC中平衡凝膠至少10分鐘。

        四、轉膜

        將凝膠中的單鏈DNA片段轉移到固相支持物上。而此過程最重要的是保持各DNA片段的相對位置不變。DNA是沿與凝膠平面垂直的方向移出并轉移到膜上，因此，凝膠中的DNA片段雖然在堿變性過程已經變性成單鏈并已斷裂，轉移后各個DNA片段在膜上的相對位置與在凝膠中的相對位置仍然一樣，故而稱為印跡（blotting）。

        五、探針標記

        用于Southern印跡雜交的探針可以是純化的DNA片段或寡核苷酸片段。探針可以用放射性物質標記或用地高辛標記，放射性標記靈敏度高，效果好；地高辛標記沒有半衰期，安全性好。

        六、預雜交（prehybridizafion）

        將固定于膜上的DNA片段與探針進行雜交之前，必須將膜上所有能與DNA結合的位點全部封閉，這就是預雜交的目的。

        （一）配制預雜交液。

        （二）把預雜交液放在滅菌的塑料瓶中，在水浴中預熱至雜交溫度。

        （三）將表面帶有目的DNA的硝酸纖維素濾膜放入一個稍寬于濾膜的塑料袋，浸濕濾膜。

        （四）將DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性。

        （五）從塑料袋中除凈2×SSC，加入預雜交液，按每平方濾膜加0.2ml。

        （六）加入變性的DNA置終濃度200μg/ml。

        （七）除凈袋中的空氣，用熱封口器封住袋口搖晃數次以使其混勻，置于42℃水浴中溫育4h。

        七、Southern雜交

        1、將標記的DNA探針置沸水浴10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性。

        2、從水浴中取出含有濾膜和預雜交液的塑料袋，將變性的DNA探針加到預雜交液中。

        3、除去袋中的空氣封住袋口，為避免同位素污染水浴，將封好的雜交袋再封入另一個未污染的塑料袋內。

        4、置42℃水浴溫育過夜（至少18h）。

        八、洗膜

        取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列條件洗膜：

        2×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；

        1×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；

        0.5×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；

        0.2×SSC/0.1% SDS，56℃，10min；

        0.1×SSC/0.1% SDS， 56℃，10min。

        采用核素標記的探針或發光劑標記的探針進行雜交還需注意的關鍵一步就是洗膜。

        九、放射性自顯影檢測

        （一）將濾膜正面向上，放入暗盒中（加雙側增感屏）。

        （二）在暗室內，將2張X光底片放入曝光暗盒，并用透明膠代固定，合上暗盒。

        （三）將暗盒置-70℃低溫冰箱中使濾膜對X光底片曝光（根據信號強弱決定曝光時間，一般在1-3天）。

        （四）從冰箱中取出暗盒，置室溫1-2h，使其溫度上升至室溫，然后沖洗X光底片（洗片時先洗一張，若感光偏弱，則在多加兩天曝光時間，再洗第二張片子）。（注：注意同位素的安全使用）

        好啦，那關于Southern blot印記雜交飾演的操作步驟我們就介紹完了，如果有幫到您一定要記得普拉特澤生物這個名字哦，您生物科研路上的好盟友（具體可做實驗請戳）。