Transwell遷移實驗報告【新人必看】
2024-02-28 11:46:16
來源/作者：普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺
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一、實驗目的
通過Transwell實驗檢測Hela細胞轉染CDC20-sgRNA3或SP600125處理后其遷移能力的變化。
二、實驗樣品及分組
1.實驗樣本
備注：包括干預細胞用的相關試劑均按實驗樣品登記，每行登記一個或一組獨立樣品
2. 實驗分組
細胞：Hela
分組：sgRNA-NC、CDC20-sgRNA3
處理：Con（0.1% DMSO）、SP600125處理（20 μM，48h）
三、實驗結果
各組侵襲實驗結果圖（100×）
各組遷移實驗結果柱形圖（遷移數）
四、實驗材料
1. 主要實驗儀器
五、實驗原理
陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內，形成DNA脂復合物，也能被表面帶負電的細胞膜吸附，再通過融合或細胞內吞進入細胞。脂質體轉染適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前實驗室最方便的轉染方法之一，其轉染率較高，優于磷酸鈣法；由于脂質體對細胞有一定的毒性，所以轉染時間一般不超過24小時。
遷移：Transwell小室上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養成分高的下室跑，計數進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力
六、實驗步驟
1.細胞復蘇
(1) 將ddH2O預溫至37℃。
(2) 戴上手套和口罩帽子，從液氮罐中取出裝有目的細胞的凍存管（內有1 mL細胞混合液），立即投入37℃ ddH2O中，輕搖凍存管使之在1分鐘內快速溶解。
(3) 完全溶解后，75%酒精擦拭凍存管外壁消毒后帶進超凈臺。
(4) 在超凈臺中，在15 mL滅菌離心管中預先加入10 mL新鮮配制的培養基，打開凍存管，將所有凍融的細胞懸液加入該離心管中，常溫1000 rpm離心3分鐘，吸除上層的培養液。
(5) 1mL培養基重懸細胞沉淀，輕輕吹打混勻后加入T25細胞培養瓶中，補足培養基至5 mL，置于37℃、5% CO2培養箱培養。
(6) 48小時后換液，細胞融合接近80%時即可傳代。
2. 細胞培養
Hela細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養基在37℃飽和濕度、含5%CO2的孵箱中培養。
3. 細胞轉染及收樣
(1) 鋪板：處于對數生長期的目的細胞，胰蛋白酶消化成單細胞懸液，按實驗需要接種于6孔板（2×105個細胞/孔），根據細胞大小和形狀調整接板細胞量。
(2) 培養：37℃、5%CO2培養箱中過夜培養，待細胞長至50%~60%匯合度進行轉染。
(3) 質粒和脂質體準備：用125μL不含血清的培養基孵育4μg目的片段；125μL不含血清的培養基孵育8μL Lipo漢恒，靜置5min；將含質粒和含有脂質體的培養基混合，混勻后室溫靜置20min。
(4) 棄去板中原有培養基，把混合液加入到細胞培養板中；4~6h后換成完全培養基。
(5) 繼續培養24-48h。
4. 遷移實驗
(1) 胰酶消化收集狀態良好的目的細胞（已轉染），制成單細胞懸液（無血清培養基配置，藥物處理組含藥物）；上室加200μL已調節好細胞密度的細胞懸液（7×103個）；下室加500μL全培養基（小室外，24孔板孔內；藥物處理組含藥物）。
(2) 于37℃、5% CO2細胞培養箱培養相應時間；
(3) 用4%多聚甲醛室溫固定20 min，用棉簽輕柔擦拭以去除小室內未遷移過去的細胞，注意操作以免刺穿底層聚碳酸酯膜；
(4) 在新的24孔板孔中加500μL結晶紫，室溫染色10 min；
(5) 用PBS沖洗掉小室上多余的染料，置于空氣中晾干；
(6) 100倍顯微鏡拍照，再用PS計數，計算各孔穿過膜的細胞數量。
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