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實驗介紹
【應用簡介】
細胞增殖是生物體生長、發育、繁殖和遺傳的基礎，與細胞凋亡、細胞周期等是腫瘤研究的重要表型，同時也是分子生物學和藥理學研究的重要內容。MTT或CCK8是檢測細胞增殖的常用手段，可研究藥物對細胞的毒性作用；或探究過表達或干擾細胞中某個基因對細胞增殖能力的影響，為進一步研究基因的功能提供依據等。
【MTT技術原理】
MTT(噻唑藍)，可透過細胞膜進入細胞內，活細胞線粒體中的脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍紫色結晶并沉積在細胞中，而死細胞無此功能；結晶物能溶于DMSO中，通過酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，間接反映活細胞數量（一定范圍內，OD值越大，細胞活性越強）。
【CCK8技術原理】
CCK-8試劑中的WST-8，可在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被活細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物；用酶聯免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞量（一定范圍內生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比）。
【實驗方法】
Step1：細胞培養及狀態調整；
Step2：鋪板；
Step3：過夜培養，待細胞貼壁及穩定；
Step4：藥物處理；
Step5：MTT呈色：避光加MTT溶液，37℃孵育4 h，孵育完成后除盡孔內上清，每孔加150μL DMSO，振蕩10min；
CCK-8呈色：避光加CCK-8溶液，孵育37℃ 1-4 h；
Step6：上機檢測：MTT-490nm；CCK8-450nm；
Step7：分析數據：以OD值或細胞相對存活率作圖。
注：如研究某基因對細胞增殖能力的影響，采取先轉染后鋪板的原則。
案例展示
案例一：細胞相對存活率%
注：相對存活率%=（實驗組OD值-調零孔OD值）/（空白組OD值-調零孔OD值）×100
*表示實驗組與其對照組比較差異顯著（ 0.01＜P＜0.05）
**表示實驗組與其對照組比較差異極顯著（P＜0.01）
結果分析：
1、空載對照組與空白組無顯著差異，表明載體正常，對細胞增殖無明顯影響。
2、過表達X基因可促進目的細胞的增殖，與對照組相比差異顯著。
案例二：IC50：指某一藥物或者物質(抑制劑)在抑制某些生物程序（如酶、細胞受體、微生物）的半量，即50%抑制濃度。
結果分析：
1、當A藥物處理目的細胞24h時，藥物的半數抑制濃度為31.39μg/mL；
2、當A藥物處理目的細胞48h時，藥物的半數抑制濃度為9.98μg/mL。
技術總結
【常見問題及注意事項】
1、鋪板密度不合理，均勻度不一致；
2、實驗分組不嚴謹；
3、實驗設置時間點不合理；
4、MTT或CCK8加樣時注意事項不明確；
5、血清等影響：高濃度血清或藥物顏色會影響試驗孔的吸光度值；
6、邊緣效應：邊緣孔的水分揮發較快，藥物易被濃縮。
送檢與交付標準
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 凍存細胞 | 1.取對數生長期的細胞，消化離心收集細胞，加入凍存液吹打混勻，裝入凍存管，標明細胞名稱/細胞代數，凍存細胞數量在1-5*106個/ml。 2.項目啟動后細胞復蘇，復蘇后3天反饋細胞狀態，3-5天反饋細胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細胞詳細信息（名稱、培養基和其他培養條件等，如經過特別處理需告知并提供必要的信息） | 液氮 | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標記，且標記清晰可識 |
| 復蘇后細胞 | 1.使用T25培養瓶運輸。細胞匯合度達到60%以上，裝滿培養液，只留紐扣大小的氣泡，瓶口用封口膜封好，標明細胞名稱/細胞代數/接種時間/培養基類型，瓶子固定運輸。 2.收到細胞后3天反饋細胞狀態，3-5天反饋細胞污染情況，5-7天反饋支原體污染情況。 3. 細胞詳細信息（名稱、培養基和其他培養條件等，如經過特別處理需告知并提供必要的信息） | 常溫 | 常溫 | |
| 質粒 | 1.純度高，無內毒素，無蛋白質，基因組DNA/RNA污染，質粒A260:A280的比值在1.8-2.0之間 2.濃度不低于0.5μg/μl，總量大于100μg，無內毒素處理 3. 載體詳細信息，包括名稱、大小、抗性、熒光標記 | -20℃ | 冰袋 | |
| 病毒 | 1.慢病毒：滴度不低于1*108TU/ml，體積約200μl，標明制備時間，且沒有反復凍融 2.腺病毒：滴度不低于1*109PFU/ml，體積約200μl，標明制備時間，且沒有反復凍融 3.明確是否表達熒光標簽蛋白及其種類，最好需要提供病毒載體圖譜； | -80℃ | 干冰 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
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