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        Tunel染色實操注意事項由普拉特澤生物——病理實驗平臺技術為大家總結分享。Tunel是分子生物學與形態學相結合的研究方法，能準確地反映出細胞和組織凋亡的典型生物化學和形態特征，普拉特澤生物承接細胞、組織樣本細胞凋亡檢測外包幾百例，總結出操作過程中容易被實驗員忽略的注意事項，分享給大家：

        1、Tunel檢測固定注意事項

        （1）固定液建議使用4%的多聚甲醛（PBS）進行固定，不建議選用乙醇和甲醇，也不能選用甲醛替代，因為市面上購買得到的甲醛大多含有甲醇。這會使我們后續的染色過程中標記效率降低，難以觀察到熒光。

        （2）固定液的濃度不可過高，濃度過高的固定液會使組織邊緣迅速固定，影響液體的穿透，影響固定效果，導致組織中心的細胞自溶、DNA鏈不規則斷裂等情況的發生，實驗結果出現假陽性。

        （3）固定時間不可過長，太長的固定時間會影響試劑的染色效率。

        2、Tunel檢測需充分脫蠟水化

        脫蠟可以先 60°C 20 min，再用使用二甲苯兩次 5-10 min；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗，這些以便后面的結合反應充分、均勻。

        3、Tunel檢測孵育注意事項

        一般根據切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時間，常用 10-30 min，幾 μm 切片用短時間；幾十 μm 切片用長時間，通過摸索達到既不脫片，又能夠使后面的酶和抗體進入胞內。實驗結果出現的假陽性也可能與Tunel染色孵育步驟有關，Tunel染色液孵育時間過長，可能會出現非特異性熒光。

        4、適當延長Tunel反應液的時間

        一般是37°c 1 h，也可以根據細胞凋亡損傷程度，選擇更長的時間，可長至 2 h，但要結合你最終的背景著色。

        5、Tunel檢測操作避光

        熒光在普通光照下不能長時間保持熒光，所以，在進行需要避光操作的步驟時，我們要嚴格進行避光操作，避免熒光淬滅導致不能對實驗結果有準確判斷。

        6、Tunel檢測輕柔操作

        貼壁細胞在加藥誘導凋亡后，細胞狀態會發生改變，細胞形態皺縮邊緣，其貼壁粘附力降低。在對此細胞進行實驗染色時，需要小心操作，避免吹打造成的細胞脫落，尤其是我們在對細胞的多次洗滌時操作更要小心輕柔。

        7、Tunel檢測曝光注意事項

        在進行熒光顯微鏡觀察時，根據顯微鏡的不同，具體參數曝光時間建議在1000ms以內，增益參數建議在500%以內，或不開增益曝光時間控制再2000ms以內，過度曝光也會增加實驗的假陽性。

        好啦，Tunel染色操作時的注意事項咱們就介紹完啦，希望能夠在實際的操作中真正幫助到您，得到一個清晰漂亮好分辨的實驗結果。當然您若是有Tunel染色實驗或細胞凋亡檢測外包與代做的需求的話，歡迎直接留言，普拉特澤生物隨時在線。