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Tunel染色實(shí)驗(yàn)的常見問題與解決方法【細(xì)胞凋亡檢測(cè)】

2022-09-08 16:10:09

來源/作者:普拉特澤-病理染色技術(shù)平臺(tái)

        大家好,今天普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是TUNEL染色實(shí)驗(yàn)的常見問題與解決方法。普拉特澤生物—病理實(shí)驗(yàn)平臺(tái)承接了大量的TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡代測(cè)實(shí)驗(yàn)與技術(shù)咨詢服務(wù),同時(shí)在實(shí)操過程中也遇到了很多特殊的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,今天小編就把普拉特澤生物技術(shù)在用TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)遇到的各種問題極其解決方法總結(jié)給大家,希望能在實(shí)驗(yàn)的操作中給到大家一定的幫助!

        問題一、熒光信號(hào)弱或沒有熒光信號(hào)

   原因1:樣本處理不當(dāng)

        1)樣本切片太厚。建議適當(dāng)將切片切薄一點(diǎn),便于染色。

        2)脫蠟和水化不充分。建議脫蠟先60 oC 20 min,再使用二甲苯兩次5-10 min;而水化用梯度乙醇從高到低濃度浸洗。

        3Proteinase K的孵育時(shí)間過短。優(yōu)化Proteinase K的孵育時(shí)間,常用時(shí)間10-30 min4 μm左右的片子孵育10 min30μm左右的片子孵育30 min

        4Proteinase K濃度過低。建議蛋白酶K一般工作液濃度為20 μg/mL

        5)放置在-20 oC保存較長(zhǎng)時(shí)間的切片不新鮮,減低染色效率。建議使用新鮮切片。

         原因2:染色操作不當(dāng)

        1染色時(shí)間過短。建議一般 37 °c 孵育60 min,可以根據(jù)凋亡損傷程度,可長(zhǎng)至2 h,但要結(jié)合背景著色。

        2TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度過低。建議適當(dāng)提高TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度。

        3TdT酶失活。建議TUNEL反應(yīng)液臨用前配制,短時(shí)間在冰上保存。不宜長(zhǎng)期保存,長(zhǎng)期保存會(huì)導(dǎo)致TdT酶失活。

        4樣本干燥。加上TUNEL反應(yīng)液后,請(qǐng)蓋上蓋玻片/保鮮膜/濕盒中進(jìn)行,保證樣本均勻染色,又可防止反應(yīng)液干燥。

         原因3:熒光檢測(cè)操作不當(dāng)

        主要是因?yàn)?/span>操作未避光。由于熒光易碎滅,建議標(biāo)記與檢測(cè)樣本時(shí),載玻片要避光,觀察時(shí)要盡量快。


        問題二、非特異性染色(假陽(yáng)性高)

        原因1:樣本處理不當(dāng)

        1使用酸性或堿性固定液,導(dǎo)致DNA損傷。建議使用pH中性的固定液固定組織或者細(xì)胞。

        2固定液濃度過高,導(dǎo)致細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂、造成假陽(yáng)性。建議使用4%多聚甲醛溶液(溶于PBS)。

        3固定時(shí)間過長(zhǎng),導(dǎo)致細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂、造成假陽(yáng)性。建議控制固定時(shí)間在4 ℃放置25 min

        4蛋白酶K處理時(shí)間過長(zhǎng),破壞核酸結(jié)構(gòu),出現(xiàn)假陽(yáng)性。建議適當(dāng)縮短處理時(shí)間。

        5蛋白酶K濃度過大,破壞核酸結(jié)構(gòu),出現(xiàn)假陽(yáng)性。建議適當(dāng)調(diào)整蛋白酶K溶液濃度,一般工作液濃度為20 μg/mL

        原因2:染色操作不當(dāng)

        1TUNEL染色時(shí)間過長(zhǎng)。建議一般是 37 °c 孵育60 min,可以根據(jù)凋亡損傷程度,可長(zhǎng)至2 h,但要結(jié)合背景著色。

        2未充分清洗樣本。染色后PBS清洗次數(shù)可增加到5次,來避免切片的非特異性染色。

        問題三、熒光背景強(qiáng)

        原因1:樣本操作不當(dāng)

        1TUNEL染色時(shí)間過長(zhǎng)。建議染色時(shí)間適當(dāng),一般是 37 °c孵育60 min,避免串色。

        2TUNEL染色液濃度過大。建議增大稀釋倍數(shù),優(yōu)化濃度。

        3PBS未充分清洗樣本。在TUNEL反應(yīng)后PBS清洗次數(shù)可增加到5次,來避免切片樣本中殘留的染料。

        原因2:熒光檢測(cè)操作不當(dāng)

        曝光時(shí)間過長(zhǎng)。建議調(diào)整曝光條件,先對(duì)陰性組調(diào)整到無背景光,然后用這個(gè)曝光條件去拍攝實(shí)驗(yàn)組(可以微調(diào),但是不需要大調(diào))。

        
       好啦,那TUNEL染色的幾個(gè)常見問題咱們就介紹到這里啦,您還有遇到其他的問題,歡迎給我們留言,我們會(huì)回答后加到這片文章中跟大家一起學(xué)習(xí)哦!

        如果您有用TUNELl或流式代測(cè)細(xì)胞凋亡的需求的話,請(qǐng)相信——普拉特澤!