大家好！今天普拉特澤生物繼續跟大家一起學習——細胞自噬大盤點 

一 什么是細胞自噬
細胞自噬（Autophagy）是指細胞內受損、變性或衰老的蛋白質和細胞器在自噬相關基因 (Autophagy associated gene，Atg)的調控下被運輸到溶酶體，溶酶體對其消化降解的過程。正常的動物細胞為了維持細胞內環境的動態平衡，需要不斷降解功能失常或不需要的細胞結構，通常壽命較短的蛋白質通過泛素-蛋白酶體途徑進行降解，而壽命較長的蛋白質及細胞結構則通過自噬途徑由溶酶體降解。
二 細胞自噬的特征
目前的自噬可分為三類，包括巨自噬（Macroautophagy）、微自噬（Microautophagy）和分子伴侶介導的自噬（Chaperone-mediated autophagy，CMA），其中巨自噬是最主要，也是研究得最多的形式。細胞自噬的過程主要包括隔離膜（Phagophore）的形成、擴展、自噬體（Autophagosome）的形成、自噬體與溶酶體融合后形成自噬溶酶體（Autophagolysosome）。自噬溶酶體形成后，內含物被溶酶體中的水解酶消化。

圖1.哺乳動物的三種自噬類型

三 細胞自噬的過程
細胞自噬的過程不是一個完全被動的細胞學過程，而是細胞自身在受到外界的刺激通過一系列的細胞內信號轉導，觸發的一系列細胞維持內環境穩定的一種主動的生物學過程。完整的自噬發生過程大體分為以下4個階段：自噬的起始→隔離膜和自噬體的形成→自噬體與溶酶體融合→自噬體的裂解。

                                                                                                   圖2. 細胞自噬的過程（Li et al. Molecular Cancer, 2020）
四 常見細胞自噬的檢測方法
檢測自噬水平的方法主要有三種：電鏡觀察、Western Blot檢測和熒光蛋白標記檢測。

1.電鏡觀察

透射電子顯微鏡檢測自噬基于辨認自噬體結構，是觀察自噬現象的最直接、最經典的方法。

圖3. 透射電鏡下自噬體（單箭頭）和自噬溶酶體（雙箭頭）形態

2.Western Blot

1）自噬過程中，LC3在合成后其C端被切割變成LC3-Ⅰ，散在分布于胞漿內；當自噬體形成LC3-Ⅰ后，與磷脂酰乙\醇胺偶聯形成LC3-Ⅱ，定位于自噬體內膜和外膜，并且始終穩定保留，直到與溶酶體融合。因此可利用WB檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的變化以評估自噬的強弱。

2）p62作為自噬的重要受體，主要依賴于自噬途徑進行降解。因此，p62的蛋白水平也常常用來指示自噬的降解情況。

圖4. WB檢測LC3、p62蛋白的表達

3.熒光蛋白標記

1）GFP-LC3

無自噬時，GFP-LC3在胞漿中彌散分布；自噬形成時，GFP-LC3聚集于自噬體膜上。在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，觀察到的點狀聚集的數目即為自噬體的數量。

自噬體內膜上的LC3在溶酶體中被降解，因此，LC3的整體降解量可以通過GFP-LC3熒光的降低進行流式細胞儀定量檢測。

2）RFP-GFP-LC3 雙熒光指示系統

溶酶體內的酸性環境導致GFP熒光信號淬滅，而紅色熒光蛋白對酸性環境具有很好的耐受性，可以構建RFP-GFP-LC3串聯體。自噬形成時，自噬體呈黃色標記（綠色和紅色圖像重合），自噬溶酶體呈紅色標記。

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