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   細胞的彗星實驗原理與詳細實驗步驟由普拉特澤生物旗下的科研培訓品牌《春風學院》與細胞實驗中心聯合總結分享，根據細胞實驗中心承接的上千例彗星實驗案例匯聚而來，如果您有彗星實驗外包或其他細胞實驗的外包需求，歡迎您聯系我們的客服人員哦~
   細胞的彗星實驗背景：

   分子水平的DNA 損傷檢測方法之一。除此之外，還有wb和QPCR檢測。3個檢測手段各自依據原理不同。

   WB在于檢測目標蛋白的存在來驗證DNA 的損傷；QPCR則通過檢測DNA損傷特異基因的表達來說明DNA損傷情況，而彗星實驗是基于單細胞凝膠電泳技術，鑒于已損傷DNA相對完整DNA的實驗結果會有明顯的拖帶現象，類似于彗星的拖尾，所以被形象的稱為彗星實驗（單細胞凝膠電泳）。

    細胞的彗星實驗原理：

   當各種內外源DNA損傷因子誘發細胞DNA鏈斷裂時，DNA的雙螺旋結構受到破壞，在細胞裂解液作用下，細胞膜、核膜等膜結構受到破壞，細胞內的蛋白質、RNA以及其它成分均擴散到細胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性條件時，DNA片段可進入凝膠發生遷移，而在堿處理和堿性電解質的作用下，DNA發生解螺旋，損傷的DNA斷鏈及片段被釋放出來，由于這些DNA的分子量很小，所以在電泳過程中會離開核DNA向陽極移動，形成彗星狀的圖像，而未損傷的DNA部分保持球形。DNA受損越嚴重，產生的斷片越多并且片段越小，電泳時遷移的DNA量也就越大，遷移距離越長，熒光顯微鏡下可觀察到尾長增加、尾部熒光強度增強。在一定條件下，DNA遷移距離(彗星尾長)和DNA含量(熒光強度)分布與DNA損傷程度呈線性相關，因此，尾矩(尾部DNA的含量與尾長的乘積)成為定量測定單個細胞DNA損傷程度的主要依據。

    造成DNA損傷的因素：

    ROS X-射線 、紫外線 、抗腫瘤藥。

正常DNA

紫外線照射后的DNA

彗星實驗步驟：

   （1）彗星實驗膠板的制備

    ① 第一層膠的制備：將已預熱56℃的80uL 0.5%正常熔點瓊脂糖NMA（溶于無Ca2+，Mg2+的磷酸緩沖液PBS）滴到同樣預熱的載玻片的磨砂面，迅速蓋上干凈的蓋玻片，4℃放置10min使其凝固。

    ② 第二層膠的制備：取10μl含1000個細胞的PBS和75uL 0.5%低熔點瓊脂糖LMA（溶于無Ca2+，Mg2+的磷酸緩沖液PBS）在37℃混勻，然后輕輕揭去蓋玻片，將含細胞的LMA滴到第一層膠板上，立即蓋上干凈的蓋玻片，4℃ 放置10 min使其凝固。

    ③ 第三層膠的制備：最后在凝固的LMA層上滴加85 uL預熱37 ℃ 的0.5% LMA，蓋上蓋玻片，使其凝固。第一層膠的主要目的是使第二層平整和附著緊密，第三層膠的目的是對第二層細胞起保護作用。

    （2）彗星實驗待測細胞裂解，移去蓋玻片，將載玻片浸入新配置的細胞裂解液中至少裂解1h（在放第一片開始計時，再以同樣的順序取出，確保每張片子裂解時間相同）。此步驟的目的是溶解細胞膜及核膜，除去蛋白質、RNA等，僅存留核骨架。

    （3）DNA堿解旋 細胞裂解后，取出載玻片，用PBS沖洗2次，以去掉載玻片表面高濃度的鹽，然后將載玻片置于水平電泳槽中，倒入新配置的堿性電泳緩沖液，約覆過膠面0.25cm。堿解旋20 min，以便使DNA在堿性條件下解螺旋形成單鏈DNA，使DNA斷鏈，在電泳場中易于遷移。

    （4）單細胞電泳 在25v、300mA條件下電泳20 min。

    （5）中和與染色 電泳完畢后，將載玻片取出，濾紙吸干電泳緩沖液，用Tris-HCl（pH7.5）中和15 min。然后每片載玻片上滴加50μl 30μg/mL的溴化乙錠（EB）溶液，避光操作，蓋上蓋玻片，避光染色20 min，即可觀察。

    （6）細胞彗星實驗的結果觀察與實驗數據處理。

彗星實驗詳細步驟