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  上期我們分享原位雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告（三）大家都說(shuō)不夠詳細(xì)，有一些關(guān)于其他檢測(cè)報(bào)告沒(méi)有寫(xiě)出來(lái)，那今天普拉特澤生物就為大家專(zhuān)門(mén)出一期原位雜交檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告（四）：

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

用原位雜交技術(shù)在原位研究組織細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

用已標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測(cè)核酸中的互補(bǔ)序列雜交, 從而對(duì)組織細(xì)胞中的核酸進(jìn)行定性、定位和相對(duì)定量分析。基本原理--堿基互補(bǔ)配對(duì)原理。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1  FISH染色圖

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論

DAPI染出來(lái)的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，陽(yáng)性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的綠光（lncRNA-MAF5L）和紅光（MAF5

五、實(shí)驗(yàn)材料

1.主要儀器

2.  主要試劑

六、實(shí)驗(yàn)步驟

準(zhǔn)備:                                        

1）lncRNAProbeMix儲(chǔ)存液（20μM），恢復(fù)至室溫。

2）U6，18S內(nèi)參探針儲(chǔ)存液（20μM），恢復(fù)至室溫。

3）預(yù)雜交液：將適量BlockingSolution與Pre-hybridizationBuffer按照1：99混勻后，37℃孵育至透明澄清狀態(tài)（約30min）后，分裝保存。在使用前，須在37℃氣浴或水浴中孵育至澄清透明。

4）雜交液：將適量BlockingSolution與HybridizationBuffer按照1：99混勻，37℃孵育30min后分裝保存。在使用前，須先在37℃氣浴或水浴中孵育30min。雜交液顏色偏黃屬于正常現(xiàn)象。注：Pre-hybridizationBuffer（試劑A）和HybridizationBuffer（試劑B）從低溫取出時(shí)可能有沉淀析出，屬于正?，F(xiàn)象。

5）將適量100XDAPI染色液（試劑D）與PBS按照1：99混勻，制備1XDAPI染色液。

自備試劑：1）通透液（含0.5%TritonX-100的PBS）2）1XPBS3）4XSSC4）雜交洗液I（4XSSC，0.1%Tween-20）5）雜交洗液II（2XSSC）6）雜交洗液III（1XSSC）7）封片劑。

1.切片脫蠟水化。

2.樣本上加入適量預(yù)冷的【通透液】，室溫靜置30min；棄去【通透液】后，加入【1XPBS】清洗細(xì)胞5min，3次。

3.探針檢測(cè)

a.每個(gè)樣本加入200uL【預(yù)雜交液】，37°C封閉30min；

b.預(yù)雜交同時(shí)，將【雜交液】在37°C中預(yù)熱；

c.避光條件下，把2.5uL20uM【lncRNAFISHProbeMix儲(chǔ)存液】或【內(nèi)參FISHProbeMix儲(chǔ)存液】加入到100μl【雜交液】中；注：探針濃度可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行優(yōu)化。

d.棄去每個(gè)樣本上的【預(yù)雜交液】，加入100uL含有探針的【探針雜交液】，避光，37°C雜交過(guò)夜。

e.避光，42°C，【雜交洗液I】清洗樣本3次，每次5min，以降低背景信號(hào)；

f.避光，42°C，【雜交洗液II】清洗樣本1次；g.避光，42°C，【雜交洗液III】清洗樣本1次；h.避光，【1XPBS】清洗樣本，室溫5min。注：所有指定溫度的步驟，注意將相關(guān)試劑預(yù)熱到對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)所需溫度后再使用。

4.核染色a.避光，【1XDAPI染色液】染色10min，染色液用量以覆蓋待雜交區(qū)域所有樣本為宜；b.避光，【1XPBS】清洗樣本3次，每次5min。

5.封片避光條件下，取出切片，用封片劑將蓋玻片固定其上，進(jìn)行熒光檢測(cè)。

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