DNA pulldown實驗操作步驟【pull down外包】
2022-09-28 14:57:03
來源/作者：普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺
大家好，今天普拉特澤生物跟大家一起看的是DNA pulldown實驗操作步驟。DNA pull down是研究DNA和蛋白質互做關系的非常重要的實驗，實驗步驟由普拉特澤生物分析檢測平臺技術總結分享，歡迎科研實驗人員聯系互相交流。
1．探針設計及標記
① 采用基因組DNA做模板，經PCR擴增啟動子片段；
② 將其克隆至pMD-18T克隆載體，并測序鑒定成功；
③ 使用PCR法或末端標記法標記探針；
④ 標記的探針利用凝膠回收試劑盒純化回收探針，并檢測探針濃度；
⑤ -20℃保存，待用；
2．Pull down
① 預先混合 5 μg 生物素標記的 DNA 和 500 μg 核蛋白，置于冰上；
② 取 100μL Streptavidin-agaroseG 串珠，用冰冷 PBS 洗一次，5000 g 離心 30 秒；
③ 將 DNA 與蛋白的混合物加到串珠中，重懸珠子；
④ 4℃孵育 1 小時；
⑤ 5000g，離心 30 秒，去除上清，收集沉淀；
⑥ 用冰冷 PBS 洗串珠三次，5000 g 離心 1 分鐘，盡可能去除上清，收集沉淀；
⑦ 加入 30 μL 蛋白上樣緩沖液，重懸沉淀，沸水煮 10 分鐘，
3．蛋白質檢測-- Western Blot
① 電泳：實驗采用不連續系統蛋白質SDS-PAGE，濃度為5%濃縮膠和8~12%濃度分離膠；每孔上樣40~60 ug總蛋白，開始電壓為100 v,到達分離膠后調為120 v；
② 轉膜：轉膜為恒流轉膜，電流為200 mA，時間根據目的蛋白分子量選擇60~120 min。
③ 封閉：蛋白膜放置到TBST溶液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉膜液；加入5%脫脂奶粉封閉液，室溫50rpm，封閉60分鐘。
④ 孵育一抗：根據蛋白Marker指示將PVDF膜剪開，參考一抗濃度；將PVDF膜分別放入含各自一抗溶液中，4度孵育一抗過夜，然后放入TBST洗滌液，搖動洗滌3次，每次15 min。
⑤ 孵育二抗：參考二抗濃度，按比例稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。將PVDF膜加入稀釋好的二抗，室溫搖動孵育1h；放入TBST洗滌液，搖動洗滌3次，每次15 min。
⑥ 顯色：使用化學發光試劑，黑暗處顯色，用X光片壓片，顯影液及定影液洗片。
4．蛋白質檢測-- MS
① 切膠：用刀片切取膠粒（膠粒直徑1-2 mm），置于1.5mL EP管中。
② 清洗：用200 uL MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘。
③ 脫色：對于考染膠，加考染膠色液（25mM NH4HCO3， 50% ACN）200uL，37℃ 20分鐘或超聲脫色5分鐘，吸干，重復脫色2-3次，至藍色褪去。
④ 脫水：加ACN 100 μL脫水至膠粒變白，吸棄ACN。
⑤ 清洗：用200 μL MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘；然后用200uL 50% ACN震蕩清洗2次，每次10分鐘。
⑥ 脫水：加ACN 100 μL 脫水至膠粒變白，吸棄ACN。
⑦ 用25 mM NH4HCO3稀釋Trypsin 至12.5 mg/ml，每管加10 μL，稍微離心一下，讓酶液與膠粒充分接觸，4℃放置30 min ，待酶液被膠粒完全吸收，吸棄多余的酶液，加25 mM NH4HCO3 20uL，37℃過夜(16h)。
⑧ 質譜樣品使用德國Bruker公司的Ultraflex III質譜儀開展分析，參數設置：反射模式；
⑨ 離子源加速電壓1為24kv；
⑩ 加速電壓2為22kv；
11 離子延遲提取0.000ns；
12 真空度1.4×10-7 Torr；
13 質譜信號單次掃描累加200次；
14 使用標準Maker峰作為外標校正質譜峰，正離子譜測定，測定范圍控制在700-4000；
15 樣品的肽質量指紋圖譜，胰酶自降解峰和污染物質的峰自動剔除；
16 利用LIFT軟件將PMF強度最大的5個峰進行串級質譜分析（峰強度大于300）。
OK，那DNA pull-down實驗的詳細操作步驟我們就分享你到這里啦，如果您還有什么問題的可以直接留言，有需要DNA pull-down實驗外包或代做的老師也可以直接留言需求，技術會第一時間給到回復的！
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