DNA pulldown實驗問題答疑【pull down外包】
2022-09-28 15:20:03
來源/作者：普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺
DNA pull down實驗問題答疑由普拉特澤生物分子檢測平臺分享，上期分享了DNA pull down實驗的操作步驟，大家學習后都提出了很多關于DNA pull down實驗的問題，今普拉特澤生物的技術就來一個個回答：
問題一：DNA pull down的原理？
DNA pull down的原理是先將含脫硫生物素的DNA pull down探針結合到鏈霉親和素Beads上，再將DNA-Beads和細胞裂解液孵育，這樣DNA結合蛋白便一起吸附在Beads上。洗滌掉未結合的蛋白后，再用洗脫液將DNA結合蛋白從Beads洗脫下來，得到DNA pull down產物。DNA-protein復合物既可以做Western-Blot檢測特定蛋白是否與靶DNA片段結合，又可以做質譜鑒定篩選出與DNA片段可能互作的蛋白信息（如具體某個或某些轉錄因子/組蛋白等）。
問題二：DNA pull down的應用背景是什么？
DNA pull down以感興趣的DNA序列為中心，尋找與該序列結合的蛋白質，最常見的應用是尋找某特定基因啟動子區域的轉錄因子。
啟動子通常位于結構基因5'端上游，含有RNA聚合酶特異性結合和轉錄起始所需的保守序列。
轉錄因子也稱為反式作用因子，是一種DNA結合蛋白，它能夠與真核基因的順式作用元件特異性結合來激活或抑制基因表達。
一個基因的啟動子通常會結合多種轉錄因子，尋找啟動子序列的特異轉錄因子，有助于我們理解這些啟動子下游的功能基因是如何被調控的。
問題三：DNA pull down探針怎么設計？
DNA pull down的探針長度一般情況下控制在300-4000bp，理想區間為1000-2000bp，之所以如此設計，是因為探針太長或太短都不太好，太短結合的蛋白太少，太長的話，它會存在大量的非特異性結合（整個反應條件里面我們要求是無核酸酶的），盡量避免DNA的序列有非常多的重復結構、或者高GC含量等。
問題四：DNA Pull down如何設計對照組？
DNA Pull down的對照通常有兩種方案，一種方案是選擇一個非生物素標記的DNA序列作為對照組，將來拿到的數據，主要是去除根鏈親和素的樹脂結合的一些蛋白。 第二種方案是使用一個無義的序列，這個需要用生信的方法跟基因組數據比對。 也有對照用LacZ基因作為對照，這個比較多人用，我們有時候也會用GFP的序列，其實就是找一段無關序列。當然，如果為了有一些明確的基因序列需要剔除的話，我們可以用一些其他的基因序列作為對照組來做這個實驗。
問題五：與探針結合的蛋白怎么制備？
做DNA Pull down的蛋白一般有兩種，分別是核蛋白與總蛋白，這個有什么區別呢？因為DNA結合的區域，大多數轉錄因子，我們盡量選取核蛋白來進行，減少雜蛋白的干擾。但是有一些材料，他的細胞核或者和核蛋白非常困難，或者分離我們研究的不是跟轉錄因子的結合，而是跟組織蛋白或者結構蛋白結合的，這種情況下我們就選用總蛋白。
問題六：DNA pull down與RNA pull down的差別？
在我們大多數人的潛意識里會認為DNA pull down可能會更簡單一點，但實際上RNA成功率更高，結合的蛋白會更多，這是為什么呢？這個地方就取決于我們的探針了，做DNA Pull down的時候，我們的DNA探針是用雙鏈的，大家都知道雙鏈的DNA探針，它會形成一個雙螺旋的結構，相對來講它是比較穩。而RNA是單鏈的，它會自我形成很多的這種二級結構，我貼了一張二級結構圖，在二級結構的基礎之上，會形成三級結構，四級結構，它就像有點像是蛋白質。它會形成一個非常復雜的空間結構，這種非常復雜的空間結構相對于DNA的雙螺旋鏈來講，蛋白質的結合的概率將會大大增加，因此RNA pull down，成功率將會更高一些，當然了，這個事情也不絕對，因為RNA本身不是特別穩定的，我們操作如果說不小心或者是失誤的話啊，會出現降解的情況。
好啦，那所有的問題就都回答完啦，如果您還有關于DNA pulldown實驗外包的需求或者其他技術問題，也可以直接留言，我們會第一時間給到回復的哦，我們下個實驗見！
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