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今天普拉特澤生物跟大家一起學習的是原位雜交實驗操作注意事項，有同學跟小編留言說明明是按照步驟來的，得出的結果總是不理想甚至沒有結果，所以小編又去求著普拉特澤病理實驗平臺的技術姐姐為大家總結了這篇原位雜交操作時的各種注意事項，快點學起來吧！

        1、組織取材：組織取材應盡可能新鮮。由于組織RNA降解較快，所以新鮮組織和培養細胞最好在30 min 內固定。

        2、細胞組織固定目的與注意事項：

        （1）保持細胞結構；

        （2）最大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平；

        （3）使探針易于進入細胞或組織。

        最常用的固定劑是多聚甲醛，與其它醛類固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會與蛋白質產生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細胞或組織。

        3、原位雜交雜交液注意事項：

        （1）雜交液內除含一定濃度的標記探針外，還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等。

        （2）雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加，可以減低探針與組織標本之間的靜電結合。甲酰胺可使Tm降低，雜交液中含每1%的甲酰胺可分別使RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA的雜交溫度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。，所以雜交液中加入適量的甲酰胺，可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態結構的破壞以及標本的脫落。硫酸葡聚糖能與水結合，從而減少雜交液的有效容積，提高探針有效濃度，以達到提高雜交率的目的（尤其對雙鏈核酸探針）。

        在雜交液中加入牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等，都是為了阻斷探針與組織結構成分之間的非特異性結合，以減低背景。

        4、原位雜交探針濃度相關注意事項：

        探針濃度依其種類和實驗要求略有不同，一般為0.5—5.0 μg/ml（0.5—5.0 ng/μl）。最適宜的探針濃度要通過實驗才能確定。

        探針的長度：

        一般應在50-300個堿基之間，最長不宜超過400個堿基。探針短易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。

        好啦，那原位雜交操作時的注意事項我們就介紹到這里啦，還有更多技術問題或者原位雜交實驗外包咨詢歡迎留言給客服，我們會一個一個回復解答的哦~