GST pulldown實驗操作步驟【pull down外包】
2022-09-28 15:44:17
來源/作者：普拉特澤-生物醫學整體課題外包平臺
大家好，今天跟普拉特澤生物一起學習的是GST pull down實驗的操作步驟。上期咱們簡單介紹了一下GST pull down實驗，是一個近年來受廣大科研人員關注的驗證酵母雙雜交系統的體外試驗技術，普拉特澤生物分子檢測平臺專業為大家提供GST pull down檢測外包服務，提供真實、高質量的實驗結果。現在我們來跟著技術來看看GST pull down實驗的操作步驟：
一、GST-a融合蛋白的制備
1、GST-a融合蛋白的表達
(1)將目的蛋白與GST的重組質粒轉化到BL21菌株中；
(2)挑取單克隆到含有5mL LB培養基（加入5 μL氨芐）的10 mL試管里，37℃恒溫振蕩培養箱中培養過夜；
(3)將培養菌液轉移到含有500mL LB（含500 μL氨芐）的1L錐形瓶中，37℃，200 rpm培養數小時；
(4)測定OD600值，當OD600達到0.6左右時，加入適當濃度的IPTG，在20℃，200rpm條件下培養10-16h（通常需要進行預實驗以確定最佳IPTG濃度、誘導溫度和時間）；
(5)誘導適當時間后，將菌液分次倒入50 mL離心管中，4℃ 4000 rpm離心10分鐘，然后棄去上清，收集管底菌體，如暫時不用，可將菌體保存于-80℃冰箱中；
(6)先加入少量PBS于離心管中，離心5-10 min后棄去上清，再按每10 mL菌液沉淀1 mL PBS的量加入相應的PBS，渦旋振蕩，使菌體沉淀充分溶解于PBS溶液中；
(7)把混合菌體置于冰水浴中，用超聲儀進行破碎。每次超聲破碎20 s，間隔30 s（破碎時間、破碎次數和間隔時間視具體情況而定），經過適當時間超聲后，溶液會顯得澄清；
(8)將超聲后的溶液4℃ 4000 rpm離心10分鐘，上清液轉移至新的離心管中，-80℃保存備用。
2、GST-a融合蛋白的純化
(1)在新鮮制備的裂解液上清中加入適量體積50% Glutathione Sepharose 4B，4℃搖床上緩慢搖動30~60 min;
(2)4℃，4000rpm離心5 min，棄去上清，該Sepharose上結合了GST-a融合蛋白；
(3)加入200 μL預冷的PBS溶液，輕晃懸浮珠子，將Sepharose洗滌一次，4℃，4000 rpm離心5 min，棄去上清，重復此步驟3次；
(4)最后一次用移液槍吸走珠子表面的液體，但注意不要吸走珠子，即可獲得結合GST-a的Sepharose。
二、體外蛋白的結合
1、將結合有GST-a融合蛋白的Sepharose 4B懸浮在適量體積的緩沖液中，加入20 μL含有b蛋白的溶液，同時采用結合有GST蛋白的Sepharose作為陰性對照，在搖床上晃動4-8h（4℃）；
2、4℃，4000 rpm離心5 min，棄去上清液；
3、沿壁加入200μL預冷的緩沖液對Sepharose進行洗滌，
4、4℃，4000rpm離心5 min，棄上清，該步驟重復3次；
5、吸干Sepharose上面的液體后，加入20ul 1×蛋白電泳上樣緩沖液，沸水浴5 min，放入-20℃冰箱備用；
6、通過SDS-PAGE和Western blot進行檢測。
好啦，那關于GST pulldown實驗步驟就分享完啦，如果您也在設計GST pull down實驗的話可以留言給我們跟技術一起討論設計出最好的實驗方案哦~如果您覺得實驗讓您頭疼的話也可以把GST pull down實驗外包給我們，實驗交給我，思考留給您~
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
微信關注公眾號
湘公網安備