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   雙熒光素酶報告基因實驗操作步驟由普拉特澤生物旗下科研培訓品牌《春風學院》為大家總結分享，從樣本制備、與雙報告基因檢測兩個方面給大家詳細解說，普拉特澤承接包括雙熒光素酶實驗線下生物實驗外包服務，同時春風學院也提供線上下生物醫學實驗技能培訓，鑄就廣大實驗人員醫學科研的金身。

   一、樣品準備

   1、質粒轉染細胞

（1）細胞鋪板:將細胞按50%的密度接種到細胞培養12孔板內。

（2）轉染:16h左右細胞約70%時轉染黃光素酶報告基因質粒，每個樣品設置3個復孔。首先設計四組:

空白組（轉染試劑+細胞）

質粒組

質粒+miRNA NC組

質粒+miRNA mimics組
    2、其他準備工作

（1）配制質粒組:按照每空50ng質粒，同時每孔20ul無血清培養基計算需用量，標記為A。

（2）配制miRNANC/mimics:miRNANC/mimics的終濃度為20 nM，同時每孔20ul無血清培養基計算需用量，分別標記為B、C。

（3）配制對應轉染試劑:按照每孔05ulL轉染試劑同時每孔20uL無血清培養基計算需用量，標記為D。稀釋好的四組試劑常溫孵育5 min。

（4）將稀釋好的質粒DNA和miRNAmimics分別和對應轉染試劑混勻，常溫孵育20 min。

（5）將上一步中試劑對應加入孔中。

（6）轉染6h后，換新鮮完全培養基。

   二、雙報告基因檢測

（1）質粒共轉染36-48h后，棄去培養基，用100uL1XPBS清洗細胞。

（2）傾斜12孔板，吸干剩余的PBS。

（3）離子水將5XPLB(裂解液)稀釋成1XPLB(現配現用)，使用前放到常溫。

（4）每孔加50uL稀釋好的1XPLB，置搖床振搖20-30 min以保證裂解緩沖液完全裂解細胞。

（5）選用白色不透光的96孔酶標板中每孔加步驟4的上清液10uL，加入100uL預先混好的 Luciferase Assay ReagentII，2s后測數據，檢測熒光素酶反應強度。注意此步需在避光條件下進行。

（6）測定結束后，每孔添加100uL預先混好的Stop&Glo Reagent，靜止2s后，測數據，檢測內參海腎熒光素酶反應強度。

（7）記錄讀數:每個樣品會有3個數值:RLU1-黃火蟲熒光素酶反應強度RLU2-內參海腎熒光素酶反應強度計算兩組數據比值，即RLU1/RLU2。

（8）分析數據:比較1、2組可以發現由于對照組未轉染質粒，因此檢測不到熒光素酶反應強度。比較3.4組，由干轉染microRNAmimics進行microRNA的過表達，黃光素酶的活性降低，提示microRNA可能參與抑制靶基因的表達，需要結合定點突變等方法進一步確定 miRNA與靶基因3UTR的作用位點。

   好的，那么雙熒光素酶檢測的實驗操作步驟我們就分享完啦，還沒有學會的同學可以點擊：《雙熒光素酶原理+實操》觀看視頻教程學習哦。